Revista Panamericana de Infectología

ARTÍCULO ORIGINAL / ARTIGO ORIGINAL

Desempenho de kits comerciais e protocolos
laboratoriais para a extração de DNA
genômico bacteriano

Performance of commercial kits and laboratory protocols for
bacterial genomic DNA extraction

Carla Ariane Minatel Nogueira
Cleide Aparecida Silveira Momesso
Ricardo Luiz Dantas Machado
Margarete Teresa Gottardo de Almeida
Andréa Regina Baptista Rossit

Centro de Investigação de
Microrganismos, Depto. de Doenças Dermatológicas, Infecciosas e Parasitárias, FAMERP.

Rev Panam Infectol 2004;6(2):35-38.

Suporte financeiro: Bolsa de Iniciação Científica /FAMERP e QiagenTM

Recibido en 18/3/2004.
Aceptado para publicación en 27/5/2004.

Resumo

A obtenção de DNA genômico de boa qualidade e quantidade para amplificação pela reação em cadeia da polimerase (PCR) é fator crucial para pesquisa e diagnóstico laboratorial. Comparamos o desempenho de dois kits comerciais (QiagenTM e Invitrogen easyDNA) além de três diferentes protocolos para extração de DNA genômico bacteriano (Fervura com e sem tratamento químico-enzimático; Triton prep e Fenol-clorofórmio) quanto ao custo e possibilidade de amplificação por PCR-RAPD (DNA polimórfico amplificado randomicamente). A quantidade de DNA obtida nos diferentes protocolos foi compatível com a amplificação por PCR, contudo a qualidade do mesmo não foi satisfatória para todas as metodologias. O método com melhor desempenho para a bactéria Gram-negativa (G-) foi o de simples fervura. Já para as Gram-positivas (G+), os kits comerciais foram mais indicados. Concluímos que as diferenças entre bactérias G+ e G- devem ser consideradas na escolha do método de liberação do ácido nucléico, impossibilitando o amplo uso de protocolos de baixo custo.
Palavras-chave: DNA, Bactéria, Técnicas laboratoriais e procedimentos.

Abstract

Good quality and quantity of genomic DNA is a crucial step for successful amplification by the polymerase chain reaction (PCR) and, therefore, for research and diagnostic testing purposes. In this study we compare two commercial kits (QiagenTM and Invitrogen easyDNA) and three ïn-house laboratory protocols for extraction of bacterial genomic DNA (Boiling with and without chemical-enzymatic treatment, Triton prep and Phenol-chloroform) for the following parameters: cost and feasibility of amplification by PCR-RAPD (randomly amplified polymorphic DNA). All methods provided sufficient DNA quantities for amplification by PCR, however its quality was not always satisfactory. The best results for Gram-negative bacteria were obtained by simple boiling. On the other hand, for Gram-positive bacteria, the commercial kits provided the best results. We conclude that bacterial cell wall differences must be considered for choosing the nucleic acid liberation method, which restricts the wide use of low cost protocols.
Key words: DNA. Bacteria, Laboratorial and technical procedures.

Introdução

O uso de protocolos moleculares tem sido extensivamente aplicado em quase todos os ramos da microbiologia e uma de suas etapas cruciais é o isolamento efetivo do DNA bacteriano⁽¹⁾. Tal isolamento deve ser simples, rápido, reprodutível e de baixo custo, especialmente quando a análise de muitas espécies e linhagens se faz necessária⁽²⁾. A crescente aplicação da reação em cadeia da polimerase (PCR) na microbiologia molecular, que permite detecção e rápida identificação de patógenos, enfatiza ainda mais a necessidade do isolamento eficiente do DNA, livre de proteínas e resíduos celulares de alto peso molecular^(3,4,5). Contudo, a obtenção do mesmo, a um custo reduzido, pode ser complexa. Encontram-se disponíveis no mercado kits a preços muitas vezes não compatíveis com o orçamento de pesquisa ou mesmo da rotina laboratorial.

Um fator adicional que contribui para a complexidade da extração do DNA a partir de bactérias reside nas diferenças quanto à composição da parede celular das mesmas⁽⁶⁾. Desse modo, os diferentes protocolos de extração de DNA devem considerar essa importante diferença ao planejar a estratégia de liberação do ácido nucléico celular⁽²⁾. Nessa direção, diferentes metodologias foram descritas na tentativa de obtenção de grande quantidade de DNA a partir de bactérias Gram-positivas (G+) e Gram-negativas (G-), com maior ou menor sucesso^(2,4,5,6). Alguns procedimentos permitem o isolamento rápido e de baixo custo de boas quantidades de DNA; contudo, a purificação do mesmo mostra-se ineficiente, conforme mostrado pela razão DNA/proteínas⁽⁶⁾. Outros mostram resultados satisfatórios, porém com custo elevado⁽⁴⁾.

O trabalho realizado tem como objetivo testar diferentes metodologias para isolamento e purificação de DNA genômico a partir de duas espécies bacterianas: Staphylococcus aureus (Gram-positiva) e Serratia marcescens (Gram-negativa). Desse modo, pretende determinar o procedimento mais efetivo a um menor custo, que permita ampla utilização em projetos de pesquisa e/ou para o diagnóstico laboratorial.

Materiais e métodos

Uma cepa de Staphylococcus aureus e outra de Serratia marcescens foram isoladas e purificadas a partir da coleção do Laboratório de Microbiologia da FAMERP. Durante a fase exponencial de crescimento, cada uma das espécies bacterianas foi ressuspendida em microtubos contendo 400 ml de água Milli-Q estéril, até atingir o valor 9,0 na escala de McFarland. Posteriomente, a quantidade de bactérias foi padronizada após leitura por espectrofotometria em densidade ótica de 0,34 em 600 nanômetros. Em seguida foram realizadas a extração e a purificação do DNA bacteriano pelos seguintes métodos:

1. Fervura, com ou sem tratamento químico/enzimático⁽⁷⁾
Os microtubos foram fervidos por 10 minutos e quatro alíquotas (100 ml cada), de cada bactéria, foram submetidas a:

a) Ausência de tratamento químico/enzimático;

b) 6 ml de proteinase K (20 mg/ml) por 60 minutos, em banho-maria a 45ºC;

c) 30 ml de SDS 10% e

d) 6 ml de proteinase K (20 mg/ml) mais 30 ml de SDS 10% por 60 minutos, em banho-maria a 45ºC.

2. Fenol/clorofórmio^(2,3,8)
A cada microtubo contendo a suspensão de bactérias foram adicionados 400 ml de solução fenol saturada (1:1), visando à remoção protéica. Essa mistura foi agitada em vortex e seguiu para centrifugação por 3 minutos a 12000 rpm. A camada aquosa (DNA) foi transferida cuidadosamente para outro microtubo e a etapa fenólica, repetida. A camada aquosa foi novamente transferida para outro microtubo, onde foi adicionado igual volume (400 ml) de clorofórmio, objetivando a remoção dos resíduos do fenol. O tubo foi então agitado (vortex) e centrifugado por 3 minutos a 12000 rpm. A camada aquosa foi transferida para novo tubo, onde, em seguida, foi adicionado etanol gelado (1 ml) para precipitação do DNA. O tubo foi submetido à centrifugação, como descrito acima, o que permitiu a formação de um pellet de DNA. O etanol foi desprezado e o microtubo então deixado em temperatura ambiente para secagem parcial do DNA. Posteriormente, o pellet foi eluído em 15ml de água Milli-Q estéril.

3. Triton prep
O inóculo da bactéria G+ foi ressuspendido em 300 ml de tampão STET (8% de sacarose, 5% de Triton-X e 50mM de EDTA, pH de 8,8) mais 30 ml de uma solução de RNase/Lisozima^(2,7). Esta última solução contendo a RNase para eliminação do RNA residual e a lisozima para quebra do peptideoglicano da parede celular G+. O microtubo contendo tal solução foi fervido em banho-maria por 1 minuto e meio. Posteriormente, este microtubo passou por centrifugação a 10000 rpm, por 15 minutos. A seguir, procedeu-se o tratamento com fenol/clorofórmio e precipitação alcoólica do DNA bacteriano, como realizado no método 2.

4. Kit QiagenTM: executado segundo instruções no manual⁽⁹⁾. Aqui, a purificação seguiu método físico e o DNA foi liberado da coluna de sílica pelo tampão de eluição.

5. Kit Invitrogen easyDNA: executado segundo instruções no manual⁽¹⁰⁾, incluindo incubação em tampão TE/RNAse (10 mM Tris-Cl, pH 8,0, 1 mM EDTA, RNase 40 ìg/ml) a 37ºC por 30 minutos. Esta incubação foi efetuada para eliminação de resíduos de RNA da amostra.

Todas as alíquotas foram mantidas em freezer a –20ºC para avaliação do DNA por espectrofotometria, por eletroforese em gel de agarose e por PCR-RAPD (P1 - 5´-CTGGCGGCTG-3´).

Análise da quantidade e pureza do DNA genômico obtido

Após os procedimentos de extração, cada amostra de DNA obtida foi diluída 100 vezes em água Milli-Q (4 ml de solução de DNA para 396 ml de água), tendo sua concentração e pureza determinadas através da leitura de absorbância em 260 nm (UV - Concentração do DNA em mg/ml = Absx100x50 ìg/ml) e em 280 nm (quantificação de proteínas) no espectrofotômetro. A razão entre as leituras em 260 nm e 280 nm foi indicativa do grau de pureza do DNA obtido.

A eletroforese para verificação da qualidade do DNA extraído foi realizada em gel de agarose 1,5%. A esse gel foi aplicada uma amostra de cada um dos microtubos (8 ml de água Milli-Q, 1 ml de corante azul de bromofenol e 1 ml da solução de DNA). Após a eletroforese o gel foi corado com brometo de etídio, sendo visualizado e fotografado sob luz ultravioleta (UV).
Para verificar a possibilidade de uso posterior em técnicas moleculares, 50 nanogramas do DNA foram utilizadas para a amplificação em termociclador MJResearch, por PCR-RAPD (P1 - 5´-CTGGCGGCTG-3´).

Resultados

Todos os protocolos forneceram quantidades de DNA compatíveis com a realização da PCR, muito embora o mesmo não fosse verdadeiro quanto à qualidade (tabela 1). Desse modo, o parâmetro que mais interferiu na possibilidade de amplificação bem-sucedida foi a qualidade do DNA.

Na análise do DNA por espectrofotometria, o método de fervura (1) permitiu obtenção de DNA genômico de Staphylococcus aureus (G+) e Serratia marcescens (G-) de boa qualidade. Interessantemente, o desempenho deste método não foi potencializado pelo tratamento químico/enzimático. Por outro lado, o protocolo fenol/clorofórmio (2) forneceu DNA de qualidade inferior à simples fervura, para ambas as bactérias. De fato, considerando-se a razão DNA/proteínas, todas as metodologias, à exceção da simples fervura e do kit Invitrogen easyDNA (5) para a G-, forneceram resultados sugestivos da presença de RNA nas amostras (relação Abs260/Abs280 acima de 2,0).

A ausência de bandas definidas e de alto peso molecular em gel de agarose não foi fator preditivo para obtenção de sucesso pela PCR. Apesar dos dois primeiros métodos (Fervura e Fenol/clorofórmio) não possibilitarem a visualização de bandas definidas, provavelmente devido à pequena quantidade de DNA, foi possível o sucesso por PCR-RAPD para a bactéria G-, com a amplificação de várias bandas, inclusive de alto peso molecular (dados não mostrados). O método Triton prep (3), mostrou-se ineficiente, já que além da impossibilidade de visualização de banda em gel de agarose, não foi possível obter amplificação por PCR-RAPD nas condições aqui testadas. Por outro lado, ambas as bactérias tiveram o DNA amplificado por PCR-RAPD, quando a extração foi realizada através dos kits comerciais (QiagenTM e Invitrogen easyDNA).

Discussão

Em meados de 1980, a metodologia de PCR para amplificação de pequenas quantidades de DNA alvo foi desenvolvida com sucesso, conduzindo uma revolução nas técnicas de diagnóstico laboratorial. A despeito do enorme avanço na detecção de agentes infecciosos por tais métodos, algumas limitações foram evidenciadas. Entre elas, a co-extração de fatores inibitórios, bem como as diferenças intra e interespécies que interferem na extração do DNA genômico bacteriano^(1,11).

Neste trabalho foi efetuada a comparação de cinco métodos para extração do DNA genômico tanto em bactérias G+ como para G-, visando determinar qual método é o mais eficiente para uso em protocolos moleculares futuros.

O fato de termos observado que o parâmetro qualidade é decisivo para a obtenção de bandas por PCR-RAPD foi descrito previamente^(1,12). A explicação mais aceita reside, principalmente, na presença de resíduos contaminantes que resultam do processo de extração, tais como o fenol, e que interferem com a ação da enzima Taq DNA polimerase⁽⁶⁾.

A qualidade satisfatória do DNA genômico aqui observada pelo método de fervura está de acordo com outros autores^(6,13), que obtiveram bons resultados com este protocolo para tipagem molecular por PCR-RAPD. Contudo, a exemplo do ocorrido no presente trabalho onde só foi possível a amplificação do DNA da bactéria G-, esses autores obtiveram resultados favoráveis para G-13 ou para apenas alguns sorotipos de Leptospira sp.⁽⁶⁾. Tal discrepância foi atribuída às diferenças na parede celular6 e poderia explicar a falha aqui verificada na amplificação do DNA da bactéria G+.

Apesar de largamente utilizado como método único ou ainda como etapa de processos de extração do DNA, o fenol/clorofórmio não forneceu bons resultados para S. aureus. Este resultado pode ser atribuído, entre outras variáveis, à procedência dos reagentes utilizados, uma vez que este protocolo já forneceu bons resultados para esta mesma bactéria⁽²⁾.

De fato, a amplificação do DNA de S. aureus por PCR-RAPD não foi possível com nenhum dos protocolos in-house, nem mesmo pelo método Triton prep, mas somente por meio de kits comerciais. Uma possível explicação é a presença de resíduos específicos da parede G+ que podem interferir em alguma etapa da PCR⁽⁶⁾.

Apesar do método Triton prep e do Kit Invitrogen easyDNA possuírem etapa de digestão enzimática por RNAse, esta parece não ter sido suficiente para a eliminação total do RNA das amostras. Assim, sugerimos que as concentrações desta enzima sejam aumentadas ou o tempo de incubação modificado, quando o DNA bacteriano for preservado para uso futuro visto que, ao longo do tempo, a presença de RNA causa degradação do DNA.

Os kits comerciais, a despeito do alto custo, forneceram excelentes resultados para amplificação do DNA de ambas bactérias. No entanto, nossos resultados mostram que o método recomendado para G- é o de fervura, devido à fácil execução, obtenção de DNA de boa qualidade e amplificação bem-sucedida pela PCR, além do baixo custo. Já para a G+, os kits comerciais são os mais indicados.

Concluímos que as diferenças entre bactérias G+ e G- devem ser consideradas na escolha do protocolo de liberação do ácido nucléico, o que, infelizmente, impossibilita o amplo uso de protocolos de baixo custo.

Agradecimentos

Os autores expressam sua gratidão à técnica do Laboratório de Microbiologia da FAMERP, Luceli Ferreira Souza, pela colaboração imprescindível no desenvolvimento da etapa laboratorial deste trabalho e, pelo uso do equipamento do Laboratório de Biologia Molecular da FAMERP, às professoras Dra. Eny M. Goloni Bertollo e Dra. Érika Cristina P. Bertelli. Agradecemos ainda a Prof.ª Dra. Marina Baquerizo Martinez da Faculdade de Ciências Farmacêuticas da USP, pela doação da lisozima, sem a qual seria impossível a execução de um dos protocolos testados.

Referências

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