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| ARTÍCULO ORIGINAL / ARTIGO ORIGINAL |
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Prevalencia de bacterias anaerobias y evaluación de su resistencia a los antibióticos por el método de E-test Prevalence of anaerobic bacteria and evaluation of its resistance to antibiotics by the E-test method |
| Alberto Calvo Milagros Cárdenas Cruz Rodríguez Francisca Bertuglia Omaira Andrade Nelly Márquez Sección de Bacteriología, Laboratorio Metropolitano, Policlínica Metropolitana, Caracas-Venezuela. Rev Panam Infectol 2004;6(2):17-22. Recibido en 12/4/2004. Aceptado para publicación en 19/5/2004. |
Resumen Es bien conocida la evolución de la resistencia bacteriana a través de los años, sin embargo en el caso de las bacterias anaeróbicas estos datos son escasos debido a las dificultades que presentan las técnicas de sensibilidad antimicrobiana aprobadas para estos microorganismos para ser implementadas de rutina en los laboratorios de microbiología. En vista de esta problemática, nos planteamos la necesidad de realizar un estudio donde se evaluara la prevalencia de las bacterias anaerobias y su patrón de sensibilidad a los antibióticos, para lo cual fueron analizadas 236 cepas aisladas a partir de muestras clínicas entre Enero 2002 hasta Diciembre 2003 en el Laboratorio Metropolitano de Caracas. La identificación de los microorganismos fue llevada a cabo a través de pruebas convencionales y confirmada mediante la galería Rapid ID32A (bioMérieux), mientras que las pruebas de sensibilidad fueron realizadas mediante la técnica de Etest (AB Biodisk). Los gérmenes más frecuentemente aislados fueron: Bacteroides grupo fragilis (23,7%), Prevotella spp (19,9%), Peptostreptococcus spp (18,2%), Clostridium no perfringens (9,7%) y Clostridium perfringens (8,5%). Los porcentajes de sensibilidad obtenidos en general fueron los siguientes: clindamicina (74,2%), cloranfenicol (99,1%), imipenem (100%), meropenem (100%), cefoxitin (92,8%) y metronidazol (95,2%), correspondiéndose con los datos de la literatura internacional. Palabras clave: E-test, Anaerobios, Resistencia, Clindamicina, Metronidazol, Bacteroides. Abstract The evolution of the bacterial resistance through the years is well known, nevertheless in the case of the anaerobic bacteria these data are little due to the difficulties that present the techniques of antimicrobial sensitivity approved these microorganisms to be implemented of routine in the microbiology laboratories. In view of this problematic one we considered the necessity to make a study where one evaluated the incidence of anaerobic bacteria and its pattern of sensitivity to antibiotics, for which 236 strains isolated from clinical samples between January 2002 until December 2003 in the Metropolitan Laboratory of Caracas were analyzed. The identification of the microorganisms was carried out through conventional tests and confirmed by means of the Rapid ID32A (bioMérieux) gallery, whereas the sensitivity tests were made by means of the technique of Etest (AB Biodisk). The germs more frequently isolated were: Bacteroides fragilis group (23,7%), Prevotella spp (19,9%), Peptostreptococcus spp (18,2%), Clostridium not perfringens (9,7%) and Clostridium perfringens (8,5%). The obtained percentage of sensitivity in general were the following ones: clindamycin (74,2%), chloramphenicol (99,1%), imipenem (100%), meropenem (100%), cefoxitin (92,8%) and metronidazole (95,2%), corresponding with the data of international literature. Key words: E-test, Anaerobes, Resistance, Clindamycin, Metronidazole, Bacteroides. Introducción Las bacterias anaerobias juegan un papel importante en la patogenicidad de una amplia variedad de infecciones mixtas, donde se ven involucrados gérmenes aerobios y anaerobios, tales como neumonía por aspiración, infecciones intraabdominales, ginecológicas, de piel y partes blandas, entre otras. Estos microorganismos forman parte de la flora normal en diversas partes del cuerpo humano, siendo especialmente abundantes en el tracto gastrointestinal, la cavidad oral, piel y mucosas, convirtiéndose en patógenos oportunistas cuando se ven favorecidos por factores predisponentes, tales como la disrupción de mucosas, lo cual les permite acceder a tejidos normalmente estériles, y el uso de antibióticos con bajo o ningún espectro de acción sobre anaerobios, lo cual les facilita la proliferación por eliminación de la flora asociada. Estos factores, sumados a otros como la baja tensión de oxígeno, hacen que la mayoría de las infecciones anaeróbicas se originen a partir de miembros de la flora endógena del organismo(1). La investigación de bacterias anaeróbicas en los laboratorios de microbiología no se realiza de manera rutinaria debido a diversos factores, tales como: falta de recursos y personal entrenado en el área, y la desestimación de la alta frecuencia de aislamientos que se pueden obtener cuando se investigan en las muestras adecuadas. Sin embargo, son muchos los reportes de la literatura internacional que respaldan la alta incidencia de aislamiento de estos microorganismos y la importancia de su papel como agente etiológico de diversas infecciones(2-5). Las pruebas de sensibilidad para anaerobios son bastante laboriosas y costosas, por lo cual son de difícil aplicación en un laboratorio de microbiología de rutina. La prueba del gradiente ó E-test (AB Biodisk, Solna, Suecia), técnica que combina los principios de difusión y dilución, y con aprobación por la Foods and Drugs Administration (FDA) para ser utilizada en la determinación de la concentración mínima inhibitoria (CMI) en anaerobios, representa una alternativa de fácil aplicación a la técnica de dilución recomendada por el National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) en el manual M11-A4, sin embargo, tiene como desventaja su alto costo, lo cual limita su utilización de forma masiva(6). Como consecuencia de esto la terapéutica aplicada a los pacientes debe ser guiada a menudo por los patrones locales de susceptibilidad publicados, los cuales pueden diferir significativamente incluso entre diferentes servicios de un mismo hospital, igualmente cambios dinámicos en los patrones de resistencia pueden ocurrir para casos particulares, por lo cual es importante realizar al menos un chequeo anual de los mismos con la finalidad de detectar variaciones. Un significante nivel de resistencia a clindamicina, cefalosporinas, penicilinas y otros antibióticos beta lactámicos han sido reportados entre las bacterias anaeróbicas, en especial en gérmenes de alta incidencia como los miembros del Grupo Bacteroides fragilis. La resistencia a beta lactámicos es atribuida a la producción de enzimas tipo b-lactamasas(7), a excepción de los carbapenems que son generalmente estables a estas enzimas, sin embargo, en Japón ha sido reportada la presencia de una b-lactamasa hidrolizante de carbapenemes, una metaloenzima codificada por los genes cfiA ó ccrA que actúa sobre este grupo de drogas(8). La resistencia a otro grupo de drogas, como la clindamicina, parece estar mediada por plásmidos transferibles mientras que la de cloranfenicol es debida a la producción de la enzima cloranfenicol acetiltransferasa. En el caso de metronidazol es codificada por el gen nim, el cual ha sido encontrado en cromosomas y plásmidos. En Venezuela son pocos los laboratorios que investigan anaerobios de forma rutinaria y escasos los reportes de patrones de resistencia a los antibióticos que puedan ayudar al clínico en la elección de la terapéutica empírica inicial(9), por lo cual este estudio representa una alternativa importante por conocer la realidad en resistencia en anaerobios en nuestro medio utilizando una técnica reconocida y confiable. Materiales y métodos Las muestras para el procesamiento de anaerobios fueron recibidas en medio de transporte Portagerm Amies Agar (bioMérieux) y procesadas en un lapso no mayor de 2 horas. Fueron sembradas en los medios de agar Wilkins Chalgren (WCH) (Oxoid) suplementado con sangre de carnero al 5%, WCH suplementado con N-S (Oxoid), WCH suplementado con G-N (Oxoid), agar Feniletil Alcohol (Oxoid), Agar Bacteroides Bilis Esculina (BBE) y thioglicolato 135C (BBL) enriquecido con vitamina K y hemina. Fueron incubadas en cámara de anaerobiosis Bug Box (Ruskin Technology) por un tiempo máximo de 7 días en caso de mantenerse negativas. Para la identificación de los gérmenes fueron utilizados métodos manuales: coloración de Gram, tolerancia al oxígeno, producción de catalasa, taxos de identificación con antibióticos de baja concentración: colistina 10 ug, vancomicina 5 ug y kanamicina 1mg, reducción de nitrato, indol, hidrólisis de gelatina, inhibición por SPS, producción de ureasa, lecitinasa, lipasa y crecimiento en bilis, según el germen aislado, logrando identificación a nivel de género, siendo verificado hasta nivel de especie mediante la utilización de la galería Rapid ID32 A (bioMérieux, Mercy-I-Etoile, Francia)(10). Las pruebas de sensibilidad fueron realizadas mediante la técnica de E-test, (AB Biodisk, Solna Suecia) utilizando el medio de Wilkins Chalgren suplementado con sangre de carnero al 5%, evaluándose los siguientes antibióticos: clindamicina (CM), cloranfenicol (CL), imipenem (IMI), meropenem (MER), metronidazol (MZ) y cefoxitin (FOX). La cepa aislada y purificada fue estandarizada en solución salina estéril al 0,85% mediante uso de densitómetro Densimat® (bioMérieux) al patrón 1 McFarland, según las recomendaciones del fabricante, e incubadas 24 hrs a 35°C en cámara de anaerobiosis, prolongándose por 48 hrs, en los casos de gérmenes de crecimiento lento. Se utilizó como control de calidad la cepa de Bacteroides fragilis ATCC 25285. La interpretación de los resultados de la concentración mínima inhibitoria se realizó según los parámetros establecidos por el NCCLS en el documento M11-A4(11), siendo registrados y analizados a través del software Whonet de la Organización Mundial de la Salud. Resultados De un total de 481 muestras recibidas en el Laboratorio Metropolitano desde enero 2002 hasta diciembre 2003 para la investigación de anaerobios, 103, (21,41%), fueron positivas, aislándose un total de 236 cepas. En 70 (67,9%) de las muestras positivas se obtuvo el aislamiento de bacterias aerobias y anaerobias (flora mixta) mientras que en 33 (32,1%) de las mismas se aislaron únicamente gérmenes anaerobios. En general se obtuvo una media de 2,3 bacterias anaerobias por muestra positiva, aislándose mas de una en el 38,8% de las mismas. Las cepas fueron aisladas a partir de secreción abdominal (39%), abscesos (13%), herida operatoria (8%), ginecológicas (5%) y sangre (4%). De los 236 microorganismos aislados, Bacteroides grupo fragilis (23,7%) y Prevotella spp (19,9%) resultaron ser los gérmenes mas frecuentes, seguidos por el grupo de los anaerobios gram positivos, como puede evidenciarse en la tabla 1.  Los resultados de las pruebas de sensibilidad en general de los anaerobios aislados oscilaron entre un 100% de sensiblidad en el caso de los carbapenems hasta un 74,3% en el caso de clindamicina (tabla 2 y figura 1) comportamiento que se mantiene mas ó menos constante cuando se analizan en detalle los grupos más representativos de bacterias anaerobias aisladas, a excepción del caso de Bacteroides grupo fragilis donde la resistencia a clindamicina está cercana al 40% (tabla 3).        Discusión Las bacterias anaerobias pueden estar involucradas en cualquier tipo de infección en humanos y su recuperación en el laboratorio, si se siguen los procedimientos adecuados, no es despreciable. Existen ciertos indicios que deben hacer sospechar al clínico de la presencia de anaerobios en una determinada infección, como por ejemplo mal olor, presencia de gas, localización de la infección cercana a mucosas, terapia previa con aminoglucósidos u otras drogas con pobre actividad antianaeróbica sin mejoría del paciente y morfología a la coloración de Gram sin crecimiento en los cultivos aeróbicos, entre otros(10). Los reportes de la literatura internacional señalan una frecuencia que oscila entre el 7%, en el caso de úlceras corneales(12) donde su incidencia no es significativa, hasta un 100% en el caso de entidades como sinusitis crónica ó peritonitis, donde está descrito el importante papel que juegan estos microorganismos(13). En nuestro estudio obtuvimos una positividad del 21,41% de las muestras estudiadas, de las cuales en el 38,8% de los casos se obtuvo el aislamiento de mas de un microorganismo anaerobio. Bacteroides grupo fragilis (23,7%) y Prevotella spp (19,9%) resultaron ser los microorganismos más aislados, coincidiendo con los reportes de la literatura, respaldado además por la variante de que la secreción abdominal (39%) resultó ser la muestra a partir de la cual se obtuvo el mayor número de aislamientos en nuestro estudio. Otros gérmenes como Peptostreptococcus spp y Clostridium spp, en especial Clostridium perfringens, fueron aislados con alta frecuencia. Un punto a destacar es el aislamiento de gérmenes anaerobios en sangre, en nuestra serie el 4% de los microorganismos evaluados fueron aislados a partir de esta fuente, correspondiendo en general, con el 1% de los microorganismos aislados a partir de hemocultivos en nuestro laboratorio en el mismo período de tiempo, lo cual coincide con otros reportes que señalan su baja incidencia como agente etiológico de bacteremia y/o sepsis, sin embargo, alerta sobre la posibilidad de que en caso de la presencia de factores de riesgo su investigación debe ser llevada a cabo(3). La realización de las pruebas de sensibilidad a gérmenes anaerobios de manera rutinaria en los laboratorios es limitada motivado a diversos factores, entre los cuales se pueden citar la falta de recursos, técnicas de difícil aplicación y falta de personal con experiencia en el área. Sin embargo la necesidad de incrementar esta práctica es evidente y actualmente recomendada debido a reportes obtenidos de fallas clínicas asociadas a cepas resistentes(6). En vista de esta situación el NCCLS recomienda realizar en los grandes hospitales un chequeo anual de resistencia con la finalidad de detectar cambios en los patrones descritos en cada institución, así como para la evaluación de nuevos agentes antimicrobianos. Existen condiciones clínicas en las cuales es indispensable la realización de pruebas de sensibilidad, como en el caso de bacteremias recurrentes ó refractarias al tratamiento, infecciones del sistema nervioso central, endocarditis, osteomielitis e infecciones de prótesis. Igualmente es recomendable conocer los patrones de resistencia en gérmenes anaerobios en el caso de que la cepa sea aislada a partir de un sitio normalmente estéril, no haya respuesta a la terapia empírica inicial o se requiera de un tratamiento prolongado. En nuestro estudio encontramos una excelente actividad para los antibióticos evaluados, a excepción de clindamicina, donde obtuvimos una resistencia en general cercana al 25%, datos que coinciden con los publicados por otros autores(14-16). Todos los aislamientos fueron sensibles a los carbapenems evaluados (imipenem y meropenem), con valores de concentración mínima inhibitoria muy bajos (MIC90 0,38 ug/ml) lo cual los convierte junto a su amplio espectro de acción en excelentes drogas para el tratamiento de infecciones anaeróbicas, donde la etiología mixta es frecuente. En el caso de metronidazol, droga utilizada frecuentemente para el tratamiento antianaerobio y de patologías específicas como la diarrea asociada a antibióticos y la colitis pseudomembranosa, causada por Clostridium difficile, se demuestra que mantiene una excelente actividad (5% de resistencia) a pesar de su uso rutinario en estas entidades clínicas. Los otros dos antibióticos evaluados en nuestro estudio, cloranfenicol y cefoxitin, ampliamente usados en el pasado, muestran igualmente resistencias menores al 10%, lo cual puede deberse en parte a la disminución en su uso de manera rutinaria motivado a la toxicidad y poder bacteriostático del primero y a la búsqueda de opciones con mayor espectro de acción y no selectores de mutantes de resistencia en otros grupos, como las enterobacterias, en el caso del segundo. Cuando revisamos los resultados obtenidos por germen, observamos que la tendencia general de resistencia se mantiene en Prevotella spp, Peptostreptococcus spp y Clostridium perfringens, sin embargo en el caso específico de Bacteroides grupo fragilis observamos que la resistencia a clindamicina aumenta a valores cercanos al 45% con un MIC90 de 512 ug/ml, la cual al parecer, según datos preliminares y que no presentamos en este estudio debido al número reducido de cepas disponibles, se ve mucho mas acentuada a nivel de las especies no fragilis, donde obtuvimos una sensiblidad a clindamicina solamente del 38,9%, lo cual representa un dato importante si tomamos en cuenta el amplio uso de este antibiótico y la frecuencia de aislamiento de estos microorganismos en las infecciones anaeróbicas. Es importante hacer notar que el tratamiento de estas infecciones es a menudo multidisciplinario, estando involucrados otros factores tales como el drenaje quirúrgico adecuado y el debridamiento del tejido, además de la respuesta inmunológica del paciente ante el agente agresor, por lo cual, además de evaluar los resultados de las pruebas de sensibilidad, debe realizarse un seguimiento de la evolución clínica del paciente antes de establecer cambios en la terapéutica. Los resultados obtenidos en nuestro estudio coinciden con los datos publicados en la literatura internacional en cuanto a frecuencia de aislamiento y resistencia a los antibióticos evaluados, y representa el primer intento en Venezuela por establecer datos confiables que orienten al clínico en la elección de una terapéutica empírica inicial segura. Actualmente se han incluido en nuestro centro 2 nuevas drogas en el grupo de antibióticos a probar contra bacterias anaerobias, piperacilina/tazobactam y ertapenem, lo cual complementará en el futuro la información disponible a nivel de resistencia bacteriana en anaerobios en nuestro medio. Es imprescindible, sin embargo, que cada centro realice su propia vigilancia con el fin de establecer sus verdaderos datos y conocer su realidad microbiológica, ya que como es bien sabido estos pueden variar de una institución a otra. Igualmente recomendamos la realización de estudios donde se evalúe la resistencia de las bacterias anaerobias a los antibióticos y su correlación con la evolución clínica del paciente, con la finalidad de establecer conclusiones al respecto. Agradecimiento Los autores del presente estudio desean agradecer al Dr. Kenneth Aldridge del Departamento de Medicina (Enfermedades Infecciosas) de la Universidad del Estado de Louisiana, Estados Unidos, por la revisión y comentarios al manuscrito presentado. Referencias 1. Hentges DJ. The anaerobic microflora of the human body. Clin Infect Dis 1993;16:S175-S180. 2. Bartlett JG. Anaerobic bacterial infections of the lung and pleural space. Clin Infect Dis 1993;16:S248-S255. 3. Salonen JH, Eerola E, Meurman O. Clinical significance and outcome of anaerobic bacteremia. Clin Infect Dis 1998;26:1413-1417. 4. Becker GD, Parell GJ, Busch DF, Finegold SM, Acquarelli MJ. Anaerobic and aerobic bacteriology in head and neck cancer surgery. Arch Otolaryngol 1978;104:591-594. 5. Thadepalli H, Gorbach SL, Keith L. Anaerobic infections of the female genital tract: Bacteriologic and therapeutic aspects. Am J Obstet Gynecol 1973; 117:1034-1040. 6. Hecht DW. 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