| ARTÍCULO ORIGINAL / ARTIGO ORIGINAL |
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Estudio de la inmunogenicidad y capacidad protectora de una biblioteca genómica de expresión de Trypanosoma cruzi en ratones BALB/c Construction and evaluation of immunogenicity and induced protection in Balb/c mice immunized with a genomic library of expression of Trypanosoma cruzi |
| Aniran Ruíz Espinosa1 Esteban Alberti Amador2 Ana M. Montalvo Alvarez3 Armando Acosta Domínguez4 María E. Sarmiento García San Miguel5 Rocío García Miniet6 Maximo B. Martínez Benitez7 Luis Izquierdo8 1Médico Especialista de 1er Grado en Microbiología. Master en Parasitología, Instituto de Medicina Tropical Pedro Kouri (IPK), Ciudad de La Habana, Cuba. 2PhD. Médico Especialista de 2doGrado en Microbiología. Investigador Auxiliar. Centro International de Restauración Neurológica (CIREN), Ciudad de La Habana, Cuba. 3Lic. en Biología. Investigador Agregado, Instituto de Medicina Tropical Pedro Kouri (IPK), Ciudad de La Habana, Cuba. 4PhD. Médico Especialista de 2do Grado en Inmunología. Investigador Titular, Instituto de Suero y Vacuna Finlay, Ciudad de La Habana, Cuba. 5PhD. Médica Especialista de 2do Grado en Fisiología y Patología. Investigador Titular. Instituto de Suero y Vacuna Finlay, Ciudad de La Habana, Cuba. 6Lic. en Bioquímica. Centro International de Restauración Neurológica (CIREN), Ciudad de La Habana, Cuba. 7Lic. en Radioquímica. Aspirante Investigador, Instituto de Suero y Vacuna Finlay, Ciudad de La Habana, Cuba. 8Lic. En Matemática. Instituto de Suero y Vacuna Finlay, Ciudad de La Habana, Cuba. Rev Panam Infectol 2004;6(3):19-25. Recibido en 21/5/2004. Aceptado para publicación en 21/9/2004. |
Resumen Se construyó una biblioteca genómica de expresión de Trypanosoma cruzi (T. cruzi) utilizando como vector el plásmido pcDNA3, con la cual se inmunizaron ratones de la línea isogénica BALB/c por vía intramuscular. Se empleó un grupo control positivo al que se le administró antígenos solubles de T. cruzi y otro grupo que recibió el plásmido utilizado para la construcción de la biblioteca genómica; un grupo no recibió inmunización. A cinco animales de cada grupo se les extrajo sangre del plexo retrorbital a las tres semanas posteriores a la tercera inmunización, para estudiar la respuesta de anticuerpos específicos contra antígenos solubles del parásito mediante la técnica del Western blot. Quince días después de la tercera inmunización diez ratones de cada grupo fueron retados con una dosis letal de una cepa virulenta de T. cruzi. Se obtuvo una respuesta de anticuerpos significativa en los animales inmunizados con la biblioteca genómica de expresión y con antígenos solubles del parásito. Se evidenció un nivel de protección en los animales inmunizados con la biblioteca genómica con relación a los no inmunizados con esta. Palabras clave: Genoma de Protozooario; Trypanosoma cruzi; Vacunas de ADN; Ratones BALB/c. Abstract We constructed a genomic library of expression of Trypanosoma cruzi (T. cruzi) using the plasmid vector pcDNA3 to immunize isogenic Balb/c mice by intramuscular via. A positive control group was inoculated with soluble antigens of T. cruzi, other group received the plasmid used in the construction of the genomic library and other group was not immunized. Bloat of the retroorbital plexus was extracted from 5 animals of each group three weeks after the third immunization to study the response of specific antibodies against soluble antigens of the parasite using Western Blot. Fixteen days after the third immunization, 10 mice of each group were treated with a lethal doses of the virulent strain of T. cruzi. We obtained a relevant antibody response in those animals immunized with the genomic library and soluble antigens of the parasite. This study showed a level of protection in the immunized animals with the genomic library in relation to the other animals without immunization with this genetic construction. Key words: Genome protozoan, Trypanosoma cruzi, DNA vaccine, Balb/c mice. Introducción La inmunización con ADN es una tecnología surgida a principios de los años 90 que consiste en introducir mediante inyección, moléculas de ADN, generalmente plasmídico, que contienen genes de interés de algún patógeno específico y que al ser expresados en el tejido donde fue inoculado inducen una respuesta inmune de tipo celular y humoral que en ocasiones puede conducir a la protección contra la enfermedad(1-5). Esta tecnología promete candidatos vacunales de una fácil manipulación y un bajo costo de producción que combinen las ventajas de vacunas de subunidades, y la eficacia de las vacunas de vectores vivos(6-8). Todo esto permitiría la prevención de enfermedades virales y parasitarias sin correr los riesgos de las vacunas vivas, ya sea la reversión a la virulencia o el posible desencadenamiento de infecciones mortales en huéspedes inmunodeprimidos, por citar algunos(9-12). El desarrollo de vacunas profilácticas y terapéuticas frente a los parásitos y entre ellos T. cruzi continúa siendo un reto para los investigadores de todo el mundo; dado que aún no existe una vacuna eficaz contra este parásito. El desarrollo de candidatos vacunales contra éste, a través de la caracterización de genes que codifican antígenos que estimulan inmunidad protectora, y su transferencia a vectores establecidos no ha sido posible, pues la caracterización de genes que codifican proteínas antigénicas es una tarea aún en desarrollo(11-13). Con el objetivo de desarrollar esta novedosa estrategia y profundizar en el estudio de los mecanismos inmunológicos estimulados por este tipo de vacunas, nos propusimos construir una biblioteca genómica de T. cruzi en un vector de expresión en células eucariotas y evaluar por el método de Western blot la respuesta humoral específica inducida en ratones de la línea isogénica BALB/c, inmunizados por vía intramuscular con esta construcción genética. Al mismo tiempo se evaluó la protección específica conferida en los animales inmunizados con ADN de T. cruzi. Materiales y métodos Construcción de la biblioteca genómica de expresión Cepas parasitarias Se utilizaron epimastigotes de la cepa Y (CT-IOC 106) T. cruzi. (Instituto Osvaldo Cruz, Rio de Janeiro, Brasil) en medio líquido(14). Promastigotes de la cepa MHOM/77/LTB0016 de Leishmania amazonensis (Instituto Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, Brasil). Cepas bacterianas Escherichia coli (E. coli) XL-1 Blue: F’: Tn10 proA+B+ lacl9 ^(lacZ) M15/recAl endAl gyrA96 (Nalr) thi hsd r17 (rk-mk-) supE44 relAl lac (Stratagene). Plásmido Se empleó el vector comercial pcDNA3. Vector de expresión en células superiores suministrado por la firma Invitrogen. Hold Madison, USA. Animales Se emplearon ratones machos, de la línea isogénica BALB/c con un peso entre 16 y 18 gramos y 6 semanas de edad, suministrados por el Centro Nacional de Producción de Animales de Laboratorio (CENPALAB, Bejucal, CUBA) los cuales fueron mantenidos en condiciones controladas de temperatura 20°C ± 2°C y humedad 60% con alimentación y agua ad libitum. El cuidado y las manipulaciones experimentales se realizaron por el personal de la Dirección de Modelos de Animales del Instituto Finlay e IPK. Este trabajo se llevó a cabo respetando todos los procederes experimentales con posibilidad de causar dolor o sufrimiento, respetando las normas de la ética de la investigación con animales(15). Medios de cultivo Medio Luria Bertaini (LB)(16). Compuesto por tryptona al 1%, cloruro de sodio al 0.5%, extracto de levadura al 0.5%, se ajustó a pH 7.5 y se esterilizó en autoclave a 121°C, 1 atmósfera durante 20 minutos. Para el medio sólido se empleó agar técnico #1 al 1% (Biomeriux). Medio Infusión de Hígado-Tryptosa (Biomeriux, Francia) suplementado con 10% de suero fetal de ternera (Gibco) y 50 mg/ml de gentamicina(14). Antibióticos Se usó tetraciclina a una concentración de 12.5 mg/ml, ampicillina a 50 mg/ml y gentamicina a 50 mg/ml (Boehringer Mannheim Biochemica Alemania). Patrones de peso molecular Se empleó el patrón de peso molecular (PPM) lV (Boehringer Mannheim Biochemica, Alemania) que contiene fragmentos de: 19329/7743/5526/4254/3140/2690/2322/1882/1489/1150/925/697/421/74 pb. Para el ensayo de Western blot se utilizó el patrón de peso molecular (Sigma, USA) cuyo rango de peso molecular es de 14-70 KDa. Obtención de antígenos solubles y citoplasmático de T. cruzi Epimastigotes de la cepa Y (CI-10C 106) de T. cruzi fueron cultivados en medio líquido(14). El botón celular obtenido fue sonicado (18 Hz, Soniprep 120, England) por tres veces durante 60 segundos. Finalmente el homogenizado fue centrifugado a 1.200 g x durante una hora a 4°C y el sobrenadante fue distribuido en viales de 1 mL y conservado a -70°C. Posteriormente se determinó la concentración de proteínas por el método de Lowry(17). Construcción de la biblioteca genómica de T. cruzi Se siguió la misma metodología de obtención y preparación del ADN genómico de T. cruzi, así como de la construcción de la biblioteca genómica de expresión del mismo descritas anteriormente(18-20). Brevemente, la mezcla de ligamiento, ADN genómico de T. cruzi con el ADN plasmídico del vector pcDNA3 fue transformada por electroporación(21) en células competentes de la cepa HB101 de E. coli(16). Los clones recombinantes fueron comprobados por electroforesis en gel de agarosa al 0.8% con bromuro de etidio(16), utilizando como control el plásmido nativo digerido con la misma enzima. Para la amplificación de la biblioteca genómica el resto del precultivo (980 µL), fue sembrado en 500 mL de LB con ampicillina por 16 horas, a 37°C con agitación (150 rpm). El material purificado fue diluido en solución salina 0.9% estéril, hasta obtener una concentración final de 250 µg/mL, y fue conservado a -20°C hasta el momento de su uso. El porciento de recombinantes se calculó de la siguiente forma: Porciento de recombinantes = Número de clones recombinantes x 100 Número de colonias ensayadas. Esquema de inmunización Los animales fueron divididos en 5 grupos: L: Grupo inmunizado con la biblioteca genómica de T. cruzi (n = 20). T: Grupo inmunizado con antígenos solubles de T. cruzi (n = 16). P: Grupo inmunizado con el plásmido pcDNA3 (n = 16). G: Grupo inmunizado con ADN genómico de T. cruzi (n = 16). C: Grupo no inmunizado (n = 16). Dosis y vía de administración Se administraron 25 µg de inóculo en 0.1 mL de solución salina al 0.9%, por vía intramuscular, en la región anterior de la pata trasera derecha, con excepción del grupo C que no fue inmunizado. Reinmunizaciones y obtención de las muestras Fueron reinmunizados 10 animales del grupo L, de los cuales 5 recibieron 25 µg (L2) y el resto 50 µg (L3) de la biblioteca, por la misma vía y región. El resto de los animales de este grupo no fueron reinmunizados (L1). Se reinmunizaron además, 5 animales del grupo T con una dosis de 25 µg por la misma vía y región (T2), el resto de los animales de este grupo no se reinmunizaron (T1). A cinco animales de cada grupo se les extrajo sangre, con capilares de vidrio heparinizados, del seno retrorbital, semanalmente durante las cinco primeras semanas post-inmunización, realizándose una extracción adicional en la sexta semana. Los sueros se obtuvieron por centrifugación a 400 g x a 4°C y fueron utilizados para la determinación de la inmunogenicidad humoral por Western blot en la sexta semana post reto. En la sexta semana, diez ratones de los grupos L, T, P y C fueron retados con la cepa Y T. cruzi, activada su virulencia por pases en ratones BALB/c. Determinación de la respuesta de anticuerpos específicos mediante la técnica del Western blot Las proteínas totales de T. cruzi fueron separadas por una electroforesis en SDS-PAGE (Bio Rad, USA) en condiciones desnaturalizantes, y la electrotransferencia a una membrana de nitrocelulosa se realizó en un transfer húmedo (Bio Rad, USA)(22). Las proteínas fueron separadas en un gel al 12.5% de acrilamida Las muestras de sueros (1/100), y el segundo anticuerpo (anti-inmunoglobulina G 1/2.000) se diluyeron en solución de leche descremada al 1%. El revelado se realizó con peróxido de hidrógeno y 4-cloro-1-naftol (Sigma) durante 15 minutos. La reacción se detuvo lavando las tiras de nitrocelulosa con agua destilada. Fueron consideradas con muestras positivas aquellas en las que se observara una o más bandas de reacción igual que los controles positivos de cada ensayo. Estudio de la capacidad protectora de la administración de una biblioteca genómica de expresión de T. cruzi A seis animales infectados con la cepa virulenta del parásito (tripomastigotes metacíclicos) se les extrajo sangre del seno retrorbital con capilares de vidrio heparinizados. Los tripomastigotes se lavaron con solución salina fisiológica SSF por centrifugación a 1.200 g x durante 10 minutos. La concentración de esta suspensión de parásitos fue determinada por conteo en cámara de Neubauer para, a partir de ésta, realizar una dilución de manera tal que al administrar 0.050 mL de la suspensión resultante se inocularan a 5 x 104 parásitos/mL la cual constituye la dosis letal media (DL50). Una vez retados los grupos inmunizados y no inmunizados, fueron observados diariamente registrándose la mortalidad por día. Procesamiento estadístico Para el estudio del reto la variable que estudiamos es el tiempo de sobrevida de cada sujeto dentro de cada grupo. Para la comparación de los grupos el test usado fue el de Extensión de Gehan, Peto y long-rank para varias muestras. Resultados Construcción de la biblioteca genómica de expresión En la figura 1 se observa el resultado obtenido del análisis de restricción realizado con la enzima Eco RV a los plásmidos purificados a partir de los transformantes obtenidos después de la transformación genética de E. coli con la biblioteca genómica; como resultado de este experimento se observaron 8 clones con insertos de ADN de T. cruzi entre los 10 clones seleccionados (80%) Líneas (4, 6, 7, 8, 9, 10, 11 y 13). Todos los clones recombinantes analizados en este caso muestran bandas con tallas mayores y menores que el vector digerido (Línea 2) utilizado como control. El resto de las bandas de plásmido digeridos se mantienen a nivel del vector y parecen corresponder con clones no recombinantes (Línea 5 y 12) (figura 1).  Determinación de la respuesta de anticuerpos específicos mediante la técnica de Western blot Los resultados obtenidos en la evaluación de la respuesta inmune humoral frente a antígenos solubles de T. cruzi con la utilización del método de Western blot dos semanas después de la tercera inmunización (figura 2) mostraron el reconocimiento de diferentes bandas con tallas que oscilaron en un rango aproximado entre 55 hasta 25 KDa, por el suero de los animales inmunizados con la biblioteca genómica (L1, L2, L3, L4, L5). Todos los animales reconocieron una banda de aproximadamente 55 Kda. Algunos animales en los grupos (L1 y L3) además, una banda de aproximadamente 45 Kda. Mientras que un animal reconoció adicionalmente una banda con talla aproximada de 25 KDa. Al analizar la respuesta del suero de los animales inmunizados con el vector y del suero de los animales no inmunizados considerados ambos grupos como controles negativos, no observamos reactividad de los mismos. Como era de esperar, los sueros de los animales inmunizados con los antígenos solubles de T. cruzi fueron reactivos reconociendo una diversidad de bandas correspondientes a un amplio rango de pesos moleculares (C+) (figura 2).  Estudio de la capacidad protectora de la administración de una biblioteca genómica de expresión de T. cruzi En el cuadro 1 y en la figura 3 se puede observar que todos los animales de los grupos de animales no inmunizados y los inmunizados con el plásmido vacío murieron entre los tres a cinco días post reto, para un 100% de mortalidad. En el grupo inmunizado con antígenos solubles del parásito, la mortalidad comenzó a partir del sexto día, haciéndose más intensa hacia el décimo día (60%) post inoculación y finalmente, la muerte de todos los animales se produjo el día 30. En el grupo inmunizado con la biblioteca, la mortalidad ocurrió en cuatro de los animales (40%) entre los veinte y cuarenta días post reto, el resto, 6 animales (60%) se mantuvieron con vida todo el período de observación. Como resultado del reto realizado se encontró que los ratones inmunizados con la biblioteca genómica fueron capaces de controlar la infección aguda con trypomastigotes de T. cruzi. Al comparar todos los grupos estudiados entre sí, encontramos diferencias significativas (p < 0.0001). Se detectó una sobrevida significativamente mayor (p < 0.001) en el grupo inmunizado con la biblioteca genómica, al compararlo con los demás grupos (figura 3), (cuadro 1).   Discusión Obtención de la biblioteca genómica de expresión de Trypanosoma cruzi La utilización de bibliotecas genómicas de expresión de ADN complementario (ADNc) en el caso de parásitos con ciclos de vida complejos, obliga a la obtención de bibliotecas a partir de todos los estadios evolutivos del mismo con el objetivo de contar con toda la representación antigénica(19,20,23,24). La utilización de bibliotecas obtenidas de ADN genómico podría constituir una alternativa simple de esta estrategia si asegurara la expresión de todos los genes con el uso de una sola biblioteca(25-27). Las tallas de los fragmentos seleccionados favorece potencialmente la inclusión de genes que pudieran codificar productos importantes del parásito, tal vez relacionados con su diagnóstico o la protección contra la infección causada por el mismo. Sin embargo, pensamos que este conjunto de fragmentos del genoma es también representativo de lo que el parásito expresa en una infección natural(28,29). Evaluación de la respuesta inmune específica humoral en los ratones inmunizados con la biblioteca genómica de expresión mediante la técnica del Western blot En los diferentes grupos de estudio se pudo confirmar la intensa reactividad de los sueros de los animales inmunizados con la biblioteca genómica, demostrándose que las respuestas estuvieron dirigidas contra los productos de los genes de T. cruzi representados en ella y no contra productos codificados por genes presentes en el vector de expresión. Este hecho puso de manifiesto indirectamente la expresión de los genes de dicha construcción genética, posterior a la realización de la inmunización lo cual coincide con los resultados obtenidos por la IFI(30-33). Las variaciones de la respuesta observada entre distintos animales, reflejan la composición diferente, en cuanto a genes de T. cruzi se refiere, de los distintos inóculos suministrados a los diferentes animales; ya que, si bien la dosis de ADN fue la misma, la composición de cada inóculo en cuanto a fragmentos de ADN de T. cruzi, debió ser diferente por tratarse de una biblioteca genómica y no de genes individuales bien definidos como los utilizados en otros trabajos(34-37). Otro factor importante a señalar es que en la preparación de antígenos solubles del parásito utilizada en el Western blot no están representados todos los antígenos del microorganismo, mientras que al inmunizar con una biblioteca genómica teóricamente se administran todos los genes del microorganismo, tanto las proteínas de secreción como las proteínas que no se secretan(32,33). En este caso, solo estaríamos evaluando la respuesta contra antígenos solubles semipurificados de T. cruzi, por lo que un grupo de respuestas inducidas en los animales pudo no haber sido detectada, que serían las que pudieron haberse producido contra otras proteínas del microorganismo codificado por genes presentes en el inmunógeno(38,39). Estudio de la capacidad protectora de la administración de una biblioteca genómica de expresión de T. cruzi Este resultado sugiere que los antígenos expresados in vivo después de la inmunización fueron capaces de desencadenar respuestas inmunoprotectoras al controlar la infección aguda producida por los trypomastigotes de T. cruzi, asumiendo su estructura nativa, al igual que lo hace el propio parásito; con sus péptidos intactos, e inducir cierta protección para esta especie(19,38-40). Resultados similares fueron descritos por otros autores después de la inmunización con fracciones de la biblioteca(39). Este es el primer reporte, que conozcamos, en que se estudie la respuesta in vivo de ratones inmunizados con una biblioteca del género Tripanosoma sp. Otros investigadores han mostrado resultados semejantes al inmunizar con genes que codifican para una proteína específica de T. cruzi(30,31,41). La muerte de los ratones inmunizados con la biblioteca genómica en el estudio del reto, nos hace pensar en diferentes factores que pudieran estar influyendo en este resultado; cada animal pudo haber recibido un inóculo con diferente composición genética, y algo más importante aún, los niveles de expresión de los diferentes genes administrados pudo no haber sido igual en todos los ratones inmunizados. Los resultados obtenidos a nivel experimental con este trabajo después del reto no descartan al menos teóricamente la utilidad potencial de esta metodología para la profilaxis de esta afección, sobre todo el papel que pueda tener en el control de la Enfermedad de Chagas(41,42). Las características de la infección con su elemento de cronicidad avalan también, al menos teóricamente, su potencial de aplicación terapéutica(28,29,32). Este tipo de inmunización tiene desventajas, los inóculos son variables y por tanto hay variabilidad en la expresión de los genes, por lo que pensamos en un futuro cercano trabajar con subgenotecas para una mejor identificación de los genes protectores(34,35). Con este trabajo pretendemos estimular la búsqueda de nuevas variantes en la inmunización con ácidos nucleicos de organismos eucariota, como el parásito que nos ocupa, considerando esta tecnología como una herramienta útil para la identificación de genes que codifiquen antígenos de interés vacunal(43). Referencias 1. Yu Zh, Karem KL, Kanangat S, Manickan E, Rouse BT. Protection by minigenes: a novel approach of DNA vaccines. Vaccine 1998;16:1660-67. 2. Danko I, Wolff JA. Direct gene transfer into muscle. Vaccine 1994;12:1499-1502. 3. Spier RE. 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