Resumo
Este estudo avaliou Candida sp. isolada da mucosa orofaríngea e sua sensibilidade antifúngica em 52 portadores do HIV/Aids, residentes na Região Noroeste Paulista e respectivos controles. Para tanto, foram utilizados testes clássicos, o “kit” API20IDAUX e a disco difusão para: anfotericina B, fluconazol, itraconazol e cetoconazol. O isolamento de Candida sp. foi maior (p < 0,05) em pacientes e controles, sendo o índice de colonização/infecção superior entre usuários de próteses dentárias, em ambos os grupos (p < 0,05). A freqüência de espécies “não-albicans” não diferiu (21%) nesses grupos. Todas as cepas obtidas foram sensíveis a anfotericina B, enquanto uma cepa de C. albicans foi resistente a todos os azóis. Treze por cento das cepas foram resistentes ao fluconazol, em ambos os grupos. Nossos resultados mostram que o grupo HIV/Aids é mais colonizado por Candida sp. que os soronegativos para este vírus, sem mudança na proporção Candida albicans/“não-albicans” ou no perfil de resistência aos azóis.
Palavras-chave: HIV, microbiota oral, Candida sp., drogas antifúngicas.

Abstract
This study evaluated Candida sp. and its antifungical sensitivity profile in the oral mucosa of 52 HIV/Aids carriers and respective controls in the Northeastern São Paulo State region. Classic tests and the API20IDAUX kit as well as the disc-diffusion method (anfotericin B, fluconazol, itraconazol and cetoconazol) were performed. Candida sp. isolation rate was higher (p < 0,05) in patients than controls and the colonization rate was superior among dental apparatus users, in both groups (p < 0,05). Candida “non albicans” species frequencies did not differ (21%) between these groups. All isolated strains were susceptible to anfotericin B, while one C. albicans strain was resistant to all azoles. Thirteen percent of the strains were resistant to fluconazol, in both groups. Our results show that the HIV/Aids group is more frequently colonized by Candida sp. than the serum-negative individuals, without alterations in the C. albicans/“not albicans” ratio or in the resistant phenotype to azoles.
Key words: HIV, oral flora, Candida sp., Antifungical drugs.

Introdução
As leveduras do gênero Candida sp. colonizam como agentes comensais a cavidade bucal de cerca de 30% a 35% da população adulta sem evidência de infecção e a espécie Candida albicans corresponde a 95% do total de isolados.⁽¹⁾ De fato, relatos de colonização de mucosas do trato gastrintestinal⁽²⁾ por Candida sp. e de candidíase de manifestação superficial^(3,4) têm sido descritos na literatura. Os principais fatores relacionados a esses fenômenos são o advento da síndrome da imunodeficiência adquirida (Aids) e o uso difundido da antibioticoterapia de largo espectro de ação, bem como da quimioprofilaxia antifúngica, também administrados aos portadores de neoplasias e transplantados e que, por sua vez, selecionam agentes oportunistas e cepas resistentes.⁽⁵⁾ Em pacientes soropositivos para o HIV, a candidíase de mucosa é ocorrência freqüente, sendo a C. albicans o agente responsável por cerca de 85% das infecções.^(3,6) Dentre as espécies “não-albicans”, algumas são consideradas patógenos emergentes, dentre elas a C. dubliniensis e a C. glabrata, já que, além de outras propriedades, a primeira manifesta rápida resistência após exposição ao fluconazol, enquanto a segunda tem como característica marcante a resistência intrínseca ao mesmo.⁽⁷⁾
Apesar da aprovação dos antifúngicos imidazólicos e triazólicos ter representado um grande avanço no tratamento de infecções fúngicas sistêmica e local, atualmente verifica-se que o amplo emprego desses no tratamento de patologias por leveduras tem favorecido a seleção de cepas com reduzida sensibilidade ou até mesmo a manifestação do fenótipo resistente. Por sua vez, o perfil de sensibilidade de Candida sp. aos antifúngicos difere, o que torna fundamental a identificação do agente etiológico causador da candidíase antes de iniciar a terapêutica empírica.^(8,4)

A prevalência da infecção pelo vírus HIV no Sudeste do Brasil é alta, contribuindo com cerca de 68% de todos os casos do país, sendo que o município de São José do Rio Preto destaca-se no Estado de São Paulo na quinta posição em número de casos.⁽⁹⁾ O Hospital de Base de São José do Rio Preto é um hospital escola de nível terciário, responsável pelo atendimento da grande maioria da população da Região Noroeste do Estado de São Paulo. Nesse contexto, é a referência regional para o tratamento dos portadores do HIV e doentes de Aids.

O objetivo deste estudo foi determinar as freqüências e perfil de sensibilidade antifúngica das espécies de Candida sp., isoladas a partir da mucosa orofaríngea de portadores do HIV-1, com a doença Aids manifesta ou não, e de seus respectivos controles, bem como avaliar os fatores de risco associados à presença dessas leveduras.

Pacientes e métodos
Foi efetuada a coleta a partir da mucosa oral de 52 pacientes portadores do HIV, com a doença Aids manifesta ou não, atendidos no ambulatório de Doenças Sexualmente Transmissíveis (DSTs) ou internados no Setor de Doenças Infectoparasitárias do Hospital de Base de São José do Rio Preto, utilizando-se um swab estéril de transporte. As amostras foram imediatamente encaminhadas ao Centro de Investigação de Microrganismos (CIM) para processamento. Os dados clínicos e epidemiológicos foram obtidos a partir dos prontuá­rios e entrevista, sendo em seguida anotados em ficha apropriada e posteriormente registrados em base de dados. Paralelamente à coleta realizada no grupo de pacientes, foram obtidas amostras a partir do mesmo número de indivíduos saudáveis, recrutados entre alunos e funcionários da Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto (FAMERP), pareados por etnia, idade e sexo, para constituir o grupo controle. Foram consideradas cepas colonizantes aquelas provenientes da mucosa oral de indivíduos que não referiram sintomas de candidíase oral no momento da coleta, enquanto as infectantes foram isoladas a partir de mucosas orais afetadas. As amostras foram semeadas em meio CHROMagar Candida (BioMérieux, Paris, França) e incubadas a 30°C por até cinco dias para identificação presuntiva. Em paralelo, o material obtido foi semeado em ágar Sabouraud para posterior análise micromorfológica por meio dos testes de formação do tubo germinativo e microcultivo em ágar Corn Meal CM103® (Oxoid) acrescido de Tween 80 P.S.® (Vetec) e bioquímica pelo kit comercial API 20 ID C AUX (BioMérieux, Paris, França), de acordo com instruções do fabricante. O perfil de sensibilidade antifúngica foi avaliado por disco difusão (M-44P, NCCLS),⁽⁸⁾ frente as seguintes drogas: anfotericina B, cetoconazol, itraconazol e fluconazol (CECON, Brasil). As análises foram realizadas no programa estatístico EPIINFO (versão 6.0). Para obter a independência entre as proporções foram utilizados o teste do qui-quadrado e o teste exato de Fisher. O nível de significância adotado foi de 5%.

Aspectos éticos
O protocolo deste estudo foi elaborado de acordo com as Diretrizes e Normas Regulamentadoras de Pesquisas Envolvendo Seres Humanos (Resolução do Conselho Nacional de Saúde n. 196/96, de 10 de outubro de 1996) e foi aprovado pelo Comitê de Ética da FAMERP (protocolo no 5386/2002). Os indivíduos aqui recrutados foram previamente elucidados quanto ao estudo a ser desenvolvido e aqueles que concordaram em participar, após a assinatura do termo de consentimento livre e esclarecido, foram incluídos.

Resultados
Para ambos os grupos, a média de idade foi de 42,71 anos (s2 = 10,37) e a faixa etária variou de 22 a 73 anos. Quanto ao gênero, a maioria (61,54%) pertenceu ao sexo masculino e, em relação à etnia, aproximadamente 81% foi classificada como caucasóide e os demais como negróides. O tempo médio de diagnóstico positivo para o HIV-1 foi de 6,72 anos, variando de um mês a 20 anos. A pesquisa do status imunológico forneceu contagem de células TCD4+ variando de 2 a 1130 U/mm3 ( = 232,44 e s2 = 270 U/mm3), enquanto a média da carga viral foi de 56260,8 cópias/mm3.
As características clínico-epidemiológicas dos portadores do HIV-1 e/ou doentes com Aids e respectivos controles estão sumarizadas na Tabela 1. O maior índice no uso de prótese dentária foi verificado no grupo HIV/Aids (qui-quadrado, p = 0,002), que também realizava higiene bucal de pior qualidade (qui-quadrado, p = 0,019). Além disso, o mesmo grupo apresentou maior fre­qüência de etilistas (qui-quadrado, p = 0,011) e de usuários de drogas injetáveis (teste exato de Fischer, p = 0,006), o que ocorreu também em relação ao uso de antibioticoterapia (46,15% em pacientes versus 2% grupo controle), antifúngicos e anti-retrovirais (84,5% em pacientes versus zero grupo controle, qui-quadrado, p < 0,001). Por fim, os portadores do HIV/doentes de Aids foram mais afetados pela candidíase orofaríngea do que os indivíduos saudáveis (teste exato de Fischer, p = 0,005).



A taxa de isolamento de Candida sp. foi significantemente maior (76,9%) no grupo HIV/Aids que no grupo controle (50% - qui-quadrado, p < 0,05). Uma relação diretamente proporcional foi verificada quanto ao número de cópias do HIV-1 e a incidência de colonização/infecção por Candida sp. (qui-quadrado, p < 0,05). Foram isoladas cerca de 79% de cepas de Candida albicans e 21% de Candida “não-albicans”, nos dois grupos estudados. As cepas de Candida “não-albicans” isoladas a partir da mucosa oral dos pacientes foram: duas cepas de C. dubliniensis, duas de C. krusei, duas de C. inconspicua, duas de C. tropicalis e, finalmente, uma como C. guillermondii e uma como C. famata. Já no grupo controle, as Candida “não-albicans” foram classificadas como: C. glabrata (três cepas) e como C. famata, C. tropicalis e C. parapsilosis (uma cepa de cada). No grupo controle, três indivíduos (7%) apresentaram dupla colonização. Em dois deles foram isoladas cepas de C. glabrata e C. albicans, enquanto um terceiro apresentou C. parapsilosis e C. albicans. Sete indivíduos do grupo HIV/Aids apresentaram diferentes combinações de espécies configurando dupla colonização (14%): dois deles portavam C. albicans e C. inconspicua; um C. albicans e C. guillermondii; um C. albicans e C. dubliniensis; um C. krusei e C. dubliniensis; um C. albicans e C. krusei e, um último, C. albicans e C. famata. O índice de colonização (única e mista) foi superior (qui-quadrado, p < 0,05) em usuários de próteses em relação aos não usuários, tanto em pacientes (figura 1) quanto nos indivíduos saudáveis. Trinta e três por cento das cepas isoladas a partir da mucosa oral desses indivíduos correspondem a Candida “não-albicans”. Dentre as cepas de C. albicans obtidas dos soropositivos para o HIV, verificou-se que 8% eram resistentes ao fluconazol, enquanto 35% foram dose-dependente (uma para o cetoconazol e 12 para o fluconazol; tabela 2). Já dentre as Candida “não-albicans”, 30% mostraram resistência ao fluconazol, enquanto 70% e 10% mostraram sensibilidade intermediária ao itraconazol e ao fluconazol, respectivamente (tabela 3). Nos indivíduos saudáveis, todas foram sensíveis ao cetoconazol. Dentre as C. albicans isoladas, 4% mostraram resistência ao itraconazol e 13% ao fluconazol. Uma única cepa resultou em perfil de dose-dependente para o fluconazol (4%). Para Candida “não-albicans”, a única cepa de C. glabrata isolada (17%) foi resistente ao fluconazol e ao itraconazol. Todas as leveduras obtidas, a partir de ambos os grupos, foram sensíveis a anfotericina B.







Discussão
É inquestionável a importância da Candida sp. como um colonizador da mucosa gastrintestinal no grupo de indivíduos soropositivos para o HIV-1.⁽⁴⁾ Nossos resultados indicam que os hábitos relacionados à higiene bucal propiciam a colonização por Candida sp., independente do status sorológico para o HIV-1, corroborando os dados descritos na literatura.^(6,10) Ademais, a maior taxa de colonização, bem como as colonizações por mais de uma espécie, também foram favorecidas pelo uso de prótese dentária. De fato, a prótese dentária atua como um sítio adicional para colonização, com a conseqüente formação do biofilme, tanto bacteriano quanto fúngico, constituindo-se em importante fator de risco, já que, por um lado, dificulta a ação do sistema imunológico e, por outro, contribui para o insucesso da terapêutica antimicrobiana.^(5,11,12)
No grupo HIV/Aids, o aumento da carga viral contribuiu para a maior propensão a desenvolver candidíase de mucosa oral (qui-quadrado, p < 0,05), conforme já descrito por outros autores.^(3,1) Porém, é importante ressaltar que a infecção oral por Candida sp., tanto em pacientes soropositivos quanto em indivíduos saudáveis, depende também de outros fatores inerentes à levedura ou a esse sítio para o seu desenvolvimento, tais como: a produção de enzimas, adesão, dimorfismo, salivação, presença de próteses, produção de toxinas, colonização bacteriana e, principalmente, aqueles ligados à defesa do hospedeiro.^(5,13,11)
Inicialmente, as espécies denominadas em conjunto como “não-albicans” foram associadas com a candidíase orofaríngea em pacientes infectados pelo vírus HIV ou entre aqueles com causas outras de imunodepressão ou ainda entre indivíduos repetida e/ou prolongadamente expostos ao fluconazol.⁽¹⁴⁾ No entanto, no presente estudo, a freqüência dessas leveduras em ambos os grupos foi similar, o que acompanha a tendência recente de isolamento das mesmas a partir de indiví­duos saudáveis, usuários de próteses dentárias, portadores de neoplasias e de fibrose cística.^(15,3) Nossos dados, aliados aos demais, sugerem que essa levedura faz parte da microbiota oral normal, com distribuição ampla e independente do status imune na população geral.

As duas cepas de C. dubliniensis aqui identificadas foram isoladas a partir de dois pacientes do grupo HIV/Aids, sendo que: ambos eram usuários de prótese dentária, um deles havia sido submetido a terapêutica antifúngica e não recebia terapia anti-retroviral, enquanto o outro nunca fizera uso de antifúngicos, mas estava sob terapia anti-retroviral há dez anos. De fato, a presença do vírus HIV, somada ao uso de antifúngicos e/ou anti-retrovirais, em especial entre os usuários de prótese dentária, já foi referida como predisponente à colonização por C. dubliniensis.^(11,7)

Ficou evidenciado neste estudo que a dupla colonização da mucosa oral por cepas de Candida sp. ocorre mais em portadores do HIV/doentes de Aids do que em indivíduos saudáveis (qui-quadrado, p = 0,05), conforme previamente descrito.^(14,1)

Tradicionalmente, a inversão na proporção de C. albicans versus “não-albicans”, com o crescente aumento no isolamento das últimas, ocorre em pacientes soropositivos para o HIV e doentes com Aids.^(15,14,5) Contudo, neste estudo, a taxa de isolamento de espécies “não-albicans” em ambos os grupos não diferiu, confirmando pesquisas recentes que demonstram a substituição de C. albicans da flora comensal oral de indivíduos saudáveis por cepas de Candida “não-albicans”.^(3,10,16) As causas para tanto não estão totalmente esclarecidas, parecendo que a exposição social ao patógeno é um fator contribuinte para a disseminação de novas espécies de Candida.⁽³⁾

Quanto ao perfil de sensibilidade antifúngica, observa-se uma tendência das cepas obtidas a partir do grupo HIV/Aids em se tornarem resistentes aos antifúngicos azólicos testados. Este fato merece atenção, pois essas cepas podem alcançar a corrente sangüínea e culminar em candidemia disseminada refratária a tratamento, já que a maioria dos pacientes estava sob terapia com antibacterianos (58%) e pelo menos 20% deles possuía um ou mais dos demais fatores de risco para tal ocorrência (internação em UTI, uso de dispositivos invasivos, neutropenia).⁽¹⁴⁾ Já no grupo controle, 13% das leveduras isoladas foram resistentes ao fluconazol, apesar de seus portadores não terem sido expostos previamente a esse azol. Alguns estudos relacionam achados atípicos como este ao uso de próteses dentárias, má higiene bucal, abuso de drogas antifúngicas e candidíases recorrentes, fatores também obser­vados nos indivíduos desse grupo.^(11,10) Outra possível explicação para tal resultado reside na metodologia utilizada para determinação do perfil de sensibilidade aos antifúngicos, a disco difusão, uma limitação que reconhecemos. Por sua vez, das cepas de Candida “não-albicans” isoladas a partir da mucosa oral do grupo de pacientes, 50% demonstraram perfil de sensibilidade dose-dependente aos antifúngicos azólicos, enquanto 25% apresentaram resistência (tabela 3). Já no grupo controle, das cepas de Candida “não-albicans” isoladas, apenas uma cepa (17%) foi resistente ao fluconazol e ao itraconazol, sendo que as demais foram sensíveis a todos os antifúngicos. Observa-se, portanto, que as cepas de Candida “não-albicans” isoladas da mucosa oral dos pacientes exibiram tendência superior ao desenvolvimento de resistência a drogas antifúngicas do que aquelas do grupo controle, conforme previamente descrito.^(5,4,7)

Os dados obtidos mostraram que o grupo HIV/Aids é mais colonizado por Candida sp. que os soronegativos para este vírus, sem mudança na proporção C. albicans/”não-albicans” ou no perfil de resistência aos azóis. Uma vez que o isolamento dos agentes leveduriformes do gênero Candida sp. tem fornecido resultados que mostram importante mudança qualitativa nas espécies que compõem a microbiota oral,⁽¹⁴⁾ a identificação da espécie constitui etapa importante. Nossos dados sugerem que a resistência em isolados orais de Candida sp. ao fluconazol na Região Noroeste paulista pode ser preocupante, uma vez que não está restrita aos portadores do HIV/doentes com Aids. Por fim, a prótese dentária deve ser considerada fator de risco para a colonização/infecção por Candida sp, independentemente do status imunológico do usuário.

Agradecimentos e financiamento
Os autores agradecem a todos os indivíduos que participaram do estudo e ao auxílio financeiro da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo - Fapesp (02/09546-1). T.D.C. é bolsista do PIBIC/CNPq - FAMERP e G.M.C.R é aluna de mestrado do Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde da Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto.

Referências
1. Samaranayake LP, Holmstrup P. Oral candidiasis and human immunodeficiency virus infection. J Oral Pathol Med. 1998;18:554-564.
2. Rossit AR, Almeida MT, Nogueira CA, Oliveira JGC, Barbosa DM, Moscardini AC et al. Bacterial, yeast, parasitic, and viral enteropathogens in HIV-infected children from Sao Paulo State, Southeastern Brazil. Diagn Microbiol Infect Dis. 2007;57:59-66.
3. Leigh JE, Shetty K, Fidel PL Jr. Oral opportunistic infections in HIV-positive individuals: review and role of mucosal immunity. AIDS Patient Care STDS. 2004;18:443-456.
4. Rozkiewicz D, Daniluk T, Sciepuk M, Kurzqtkowska B, Oldak E, Zaremba ML. Prevalence of Candida albicans in stool of hospitalized children in 2003 with or without diarrhea from the Bialystok region. Przegl Epidemiol. 2005;59:43-51.
5. Holmes AR, Niimi M, Girgis JM, Boyd DH, Cannon RD. Antifungal drug susceptibilities of comensal Candida isolates. NZ Dent J. 2002;432:36-39.
6. Ministério da Saúde. Programa Nacional de Doenças Sexualmente Transmissíveis/Aids. Algumas informações sobre Aids, sífilis congênita e gestante HIV+ no Estado de São Paulo, 1980-2004. Disponível em http://www.aids.gov.br, 2006.
7. Sullivan DJ, Moran GP, Pinjon E, Al-Mosaid A, Stokes C, Vaughan C et al. Comparison of the epidemiology, drug resistance mechanisms, and virulence of Candida dubliniensis and Candida albicans. FEMS Yest Res. 2004;4:369-376.
8. National Committee for Clinical Laboratory Standards. Reference method for both dilution antifungal susceptibility testing of yeast. National Committee for Clinical Laboratory Standards, Wayne, PA, 1997.
9. Tudela JLR, Roder L, Estrella MC, Córdoba S. Determinación de la Resistencia a los Antifungicos en el Laboratorio. III Curso Hispano – Argentino de Micología Médica, 2002.
10. Nikawa H, Mikihira S, Egusa H, Fukushima H, Kawabata R, Hamada T et al. Candida adherence and biofilm formation on oral surfaces Nippon Ishinkin Gakkai Zasshi. 2005;46:233-242.
11. Lyon JP, de Resende MA. Evaluation of adhesion to buccal epithelial cells in Candida species obtained from denture wearers after exposure to fluconazole. Mycoses. 2007;50:21-24.
12. Perezous LF, Stevenson GC, Flaitz CM, Goldschmidt ME, Engelmeier RL, Nichols CM. The effect of complete dentures with a metal palate on candida species growth in HIV infected patients. J Prosthodont. 2006;15:306-315.
13. Jones DS, McGovern JG, Adair CG, Woolfson AD, Gorman SP. Conditioning film and environmental effects on the adherence of Candida spp. to silicone and poly(vinylchloride) biomaterials. J Mater Sci Mater Med. 2001;12:399-405.
14. Basseti M, Trecarichi EM, Sanguinetti M, Bisio F, Posteraro B, Soro O et al. Incidence, risk factors, and predictors of outcome of candidemia. Survey in 2 Italian university hospitals. Diag. Microbiol Infect Dis. In press, 2007.
15. Al-Karaawi ZM, Manfredi M, Waugh AC, McCullough MJ, Jorge J, Scully C et al. Molecular characterization of Candida spp. isolated from the oral cavities of patients from diverse clinical settings. Oral Microbiol Immunol. 2002;17:44-49.
16. Yildirim MS, Hasanreisoglu U, Hasirci N, Sultan N. Adherence of Candida albicans to glow-discharge modified acrylic denture base polymers. J Oral Rehabil. 2005;32:518-525.
17. Coleman DC, Rinaldi MG, Haynes KA, Rex JH, Summerbell RC, Anaissie EJ et al. Importance of Candida species other than Candida albicans as opportunistic pathogens. Med Mycol. 1998;36:156-165.