Revista Panamericana de Infectología

NOTA PREVIA / NOTA PRÉVIA

Detecção de Cryptosporidium meleagridis
em amostras fecais de pacientes
HIV positivos no Brasil

Detection of Cryptosporidium meleagridis in fecal samples of
HIV-infected patients from Brazil

Ana Julia Urias dos Santos Araújo¹
Aparecida Helena de Souza Gomes²
Marcos Eduardo de Almeida³
Hermínia Yohko Kanamura⁴

¹Professor Assistente Doutor da Universidade de Taubaté, Taubaté, SP (este artigo constitui parte da tese de doutorado em Farmácia, área de Análises Clínicas, pela Faculdade de Ciências Farmacêuticas da Universidade de São Paulo).
²Mestre em Ciências, área de Pesquisas Laboratoriais em Saúde Pública/CCD/SES; Pesquisadora Científica do Instituto Adolfo Lutz, Laboratório de Sorocaba, SP.
³Professor Assistente Doutor da Universidade de Taubaté, Taubaté, SP.
⁴Professor Visitante da Universidade de Taubaté, orientadora credenciada no Programa de Pós-Graduação em Farmácia, área de Análises Clínicas, da Faculdade de Ciências Farmacêuticas da Universidade de São Paulo, São Paulo, SP.

Rev Panam Infectol 2007;9(2):38-40

Conflito de interesses: nenhum

Recibido en 12/2/2007.
Aceptado para publicación en 2/5/2007.

Resumo
Amostras fecais de indivíduos portadores de HIV, e com Aids, foram submetidas ao diagnóstico laboratorial de criptosporidiose. Do total de 29 amostras, 15 apresentaram oocistos de Cryptosporidium sp no exame parasitológico, 13 foram reativas em ELISA para detecção de coproantígenos e em 16 foram obtidos produtos de amplificação por Nested-PCR. Foi realizada caracterização genotípica em cinco destes produtos amplificados, por meio de PCR-RFLP com a enzima de restrição AfaI (RsaI). Dois isolados foram identificados como Cryptosporidium hominis, um como Cryptosporidium parvum e dois apresentaram perfil eletroforético correspondente a Cryptosporidium meleagridis. Esses achados trazem evidências de que diferentes espécies de Cryptosporidium circulam no ambiente, traduzindo-se em risco tanto para humanos quanto para outros animais.
Palavras-chave: Criptosporidiose, Genotipagem, Cryptosporidium meleagridis.

Abstract
Fecal samples from HIV patients were submitted to the laboratory diagnosis of cryptosporidiosis. From 29 samples, 15 showed Cryptosporidium sp oocysts in the parasitological examination, 13 were reactive for fecal antigens by ELISA, and amplification products were obtained by Nested-PCR in 16 samples. Five samples were submitted to genotypic characterization, through RFLP-PCR with restriction enzyme AfaI (RsaI). Two samples had been identified as Cryptosporidium hominis, one as Cryptosporidium parvum and two presented electrophoretic profile corresponding to Cryptosporidium meleagridis. These findings bring evidences that different Cryptosporidium species circulate in the environment, expressing risk for human and other animal species.
Key words: Cryptosporidiosis, Genotyping, Cryptosporidium meleagridis.

Introdução
Cryptosporidium spp, agente causal de doença diarréica, que pode ser bastante grave em indivíduos imunocomprometidos, mas benigna e autolimitada nos imunocompetentes, foi também responsabilizado por diferentes surtos de diarréia nos Estados Unidos, na Europa, e também no Brasil^(1,2). Estudos recentes têm demonstrado a ocorrência de diferentes espécies de Cryptosporidium causando doença diarréica em humanos, sendo Cryptosporidium parvum e Cryptosporidium hominis as duas espécies mais prevalentes⁽³⁾. Para a caracterização dos isolados, tanto clínicos quanto ambientais, a utilização de métodos moleculares é de grande valia, permitindo ampliar o conhecimento e entendimento da distribuição e biologia desses parasitos. Dentre as técnicas de caracterização genotípica, a análise do polimorfismo de fragmentos de DNA obtidos por restrição enzimática (PCR-RFLP) é uma metodologia simples e rápida para dar suporte aos estudos epidemiológicos e investigações clínicas, podendo inclusive ser utilizada em exames de rotina. Assim, o objetivo do presente estudo foi realizar a identificação genotípica de isolados de ^{Cryptosporidium} sp, obtidos a partir de pacientes HIV positivos.

Metodologia, Resultados e Discussão
Amostras fecais de 29 pacientes portadores de HIV e com Aids, atendidos no Conjunto Hospitalar de Sorocaba-SP, foram analisadas por método parasitológico (método de concentração em formol-éter e coloração por técnica de Kinyoun) e em 15 foram detectados oocistos de Cryptosporidium sp; destas, 13 foram positivas também pelo método de ELISA para detecção de coproantígenos (ProSpecT Ensaio Imunoenzimático, Alexon inc.). As 29 amostras fecais foram submetidas à extração de DNA conforme protocolo modificado, descrito por Da Silva et al.⁽⁴⁾, utilizando-se o sistema comercial Fast DNA (Bio 101), e posterior emprego do sistema de purificação de PCR QIAquick (Qiagem). A amplificação do DNA extraído foi realizada por Nested-PCR, empregando-se na primeira reação de amplificação o protocolo descrito por Pedrazza-Diaz et al.⁽⁵⁾. Dessa forma, um segmento de 769pb do gene que codifica a proteína de parede de Cryptosporidium (COWP) foi amplificado com os oligonucleotídeos iniciadores BCOWPF e BCOWPR. Em seguida, esse produto foi submetido à segunda amplificação com os oligonucleotídeos iniciadores CRY9 e CRY15⁽⁶⁾, cujo produto esperado é de 553pb. As condições empregadas nas reações de amplificação estão detalhadas em trabalho já publicado⁽⁷⁾. Os produtos gerados nessas reações foram analisados por meio de eletroforese em gel de agarose 1,5%, corado com brometo de etídeo, sendo as imagens capturadas e digitalizadas em sistema Kodak Digital Science 1DTM. O resultado dessa análise revelou produto de amplificação com tamanho correspondente ao esperado (553pb) em 16 amostras, dentre as quais 11 apresentaram resultados concordantes com o exame parasitológico. Posteriormente, os produtos amplificados de cinco amostras foram caracterizados por meio de digestão com a enzima de restrição AfaI (RsaI) (Amersham Bioscience, Cat. #E1116Y).

O perfil eletroforético obtido para cada amostra foi comparado com os padrões de clivagem desse segmento do gene COWP, obtidos para diferentes espécies de Cryptosporidium, como já descrito^(6,8). Dentre os cinco isolados estudados, dois corresponderam ao padrão de restrição descrito para C. hominis, um para o padrão de C. parvum, e dois apresentaram perfil eletroforético correspondente a Cryptosporidium meleagridis (figura 1). A importância de Cryptosporidium spp como agente causal de diarréia severa e prolongada, constituindo importante causa de morbidade e mortalidade em crianças mal nutridas e nos indivíduos com imunodeficiência, está largamente discutida na literatura⁽⁹⁾. Estudos prévios realizados no Brasil relatam a detecção de Cryptosporidium spp em pacientes HIV positivos^(10-12). Das espécies aceitas atualmente, C. hominis e C. parvum são as mais freqüentemente relatadas; no entanto, outras espécies, tais como C. meleagridis, C. felis e C. canis, além de diferentes genótipos de C. parvum adaptados a animais, têm sido relatadas e foram isoladas de material clínico de pacientes com criptosporidiose e evidenciadas por métodos moleculares. Foram identificadas genotipicamente, no presente estudo, três diferentes espécies: C. hominis, C. parvum e C. meleagridis. Embora seja reduzido o número de amostras analisadas, vale salientar ser este o primeiro relato de C. meleagridis, entre indivíduos portadores de HIV, no Brasil; essa espécie infecta naturalmente diferentes espécies de aves e já foi relatada em humanos^(13-15). Esses achados trazem evidências de que diferentes espécies de Cryptosporidium circulam no ambiente, traduzindo-se em risco tanto para homens como para animais, o que justifica a aplicação de técnicas moleculares para identificação das espécies e conhecimento do modelo epidemiológico da criptosporidíase em nosso meio.

Agradecimentos
À FAPESP - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo - pelo auxílio financeiro (Processo 00/13985-5).

Referências
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