| ARTÍCULO ORIGINAL / ARTIGO ORIGINAL |
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Evaluación de la autoinmunidad en ratones BALB/c inmunizados con una biblioteca genómica de expresión de Trypanosoma cruzi Evaluation of autoimmunity in Balb/c mice immunized with a genomic library of expression of Trypanosoma cruzi |
| Esteban Alberti Amador1, Armando Acosta Domínguez2, Maria E. Sarmiento García San Miguel3, Arturo.Münster Infante4, Marulin Peña Pérez5, Aniran Ruíz Espinosa6, Rocío García Miniet7, Ana M. Montalvo Álvarez8 1 PhD. Médico Especialista de 2do Grado en Microbiología. Investigador Auxiliar. Centro Internacional de Restauración Neurológica (CIREN), Ciudad de La Habana, Cuba. 2 PhD. Médico Especialista de 2do Grado en Inmunología. Investigador Titular. Instituto de Suero y Vacuna “Carlos J. Finlay”, Ciudad de La Habana, Cuba. 3 PhD. Médica Especialista de 2do Grado en Fisiología y Patología. Investigador Titular. Instituto de Suero y Vacuna “Carlos J. Finlay”, Ciudad de La Habana, Cuba. 4 Médico Especialista de 1er Grado en Inmunología. Departamento de Inmunología Instituto Superior de Ciencias Médicas de la Habana ICBP. Victoria de Girón, Ciudad de La Habana, Cuba. 5 Médica Especialista de 1er Grado en Inmunología. Departamento de Inmunología Instituto Superior de Ciencias Médicas de La Habana ICBP. Victoria de Girón, Ciudad de La Habana, Cuba. 6 Médica Especialista de 1er Grado en Microbio-logía. Master en Parasitología. Instituto “Pedro Kourí” (IPK), Ciudad de La Habana, Cuba. 7 Licenciada en Bioquímica. Master en Bioquímica. Profesora Instructora. Centro Internacional de Restauración Neurológica (CIREN), Ciudad de La Habana, Cuba. 8 Licenciada en Biología. Investigadora Agregada. Instituto “Pedro Kourí” (IPK), Ciudad de La Habana, Cuba. Rev Panam Infectol 2005;7(2):8-15 Recibido en 28/2/2005. Aceptado para publicación en 18/5/2005. |
Resumen Uno de los problemas de la seguridad para las vacunas de ADN es la inducción de fenómenos de autoinmunidad. Nosotros examinamos el efecto de la inmunización con ácidos nucleicos de Trypanosoma cruzi en la inducción de diferentes autoanticuerpos en ratones de Balb/c. Los animales fueron divididos en cinco grupos: los primeros cuatro recibieron diferentes esquemas: 25 µg de la biblioteca genómica de expresión (grupo L), 25 µg de antígenos solubles de T. cruzi (grupo T), 25 µg del plásmido pcDNA3 (grupo P), 25 µg de genómica ADN de T. cruzi (grupo G) y un grupo control de animales no inmunizados. Los anticuerpos antinucleares y anticuerpos contra músculo cardíaco fueron evaluados por immunofluorescencia indirecta y los anticuerpos anti ADN de doble, simple cadena y el anti IgG factor reumatoideo fueron determinados semanalmente por ELISA. La vacunación no provocó la inducción de anticuerpos anti ADN de doble o simple cadena, anticuerpos antinucleares ni contra músculo cardíaco. Se observó un aumento transitorio del Factor Reumatoideo IgG en los ratones inmunizados con la biblioteca genómica de expresión de T. cruzi. Nuestros hallazgos sugieren que la inducción de respuestas autoinmunes frente al ADN utilizado en la inmunización es poco probable. Palabras clave: Genoma de protozoo, Trypanosoma cruzi, Vacunas de ADN, Ratones BALB/c, Autoinmunidad. Abstract One of the safety issues for DNA vaccines is the induction of autoimmune phenomena. We examined the effect of Tripanosoma cruzi nucleid acids immunisation in the induction of different autoantibodies in Balb/c mice. Animals were divided in five groups that received 25 µg of the genomic library (group L), 25 µg of soluble antigens of T. cruzi (group T), 25 µg of plasmid pcDNA3 (group P), 25 µg of genomic DNA of T. cruzi (group G) and control group non immunised. Antinuclear antibodies and antiheart muscle antibodies were assessed by indirect immunofluorescence and anti ds DNA, ssDNA antibodies and IgG-rheumatoid factor were determined by ELISA weekly. We observed a transient increase in the levels of IgG rheumatoid factor in both group G and L. By contrast, no production of antinuclear antibodies, antiheart muscle antibodies and anti dsDNA, ssDNA antibodies were observed during the period monitored. This finding indicate that nucleic acids immunisation did not induce a cross reactive DNA response against DNA or others antigens in our models. Key words: Protozoo, Genomic, Trypanosoma cruzi, Adn of vaccines, BALB/c mice, Autoimmunity. Introducción La Enfermedad de Chagas es causada por el hemoprotozoo Trypanosoma cruzi (T. cruzi). Esta se caracteriza por una afección autoimmune crónica(1,2) que se asocia a la producción de autoanticuerpos reactivos contra muchos tejidos propios, secundaria a la estimulación policlonal de linfocitos por los parásitos(3-5). La falta de vacuna o tratamientos eficaces contra esta entidad, ha promovido el desarrollo de nuevas técnicas de inmunización para el manejo de la enfermedad. Las vacunas de ADN representan una novedosa y eficaz forma de expresión en vivo de antígenos parasitarios, generando respuestas inmunes humoral y celular específicas contra antígenos virales, bacterianos y de parásitos(6-10). En algunos casos, este tipo de respuestas ha contribuido a la protección contra el agente infeccioso, indicando que los antígenos que se expresaron después de la inmunización con ADN indujo una respuesta de anticuerpos neutralizantes y citotóxica o auxiliada por las células T(11-13). La seguridad para el uso de estos preparados vacunales tiene gran relevancia por el riesgo potencial de transformación que tienen estos de llevar, entre otras posibilidades, a la formación de células tumorales debido a la inserción de un oncogen activo, la activación insercional de un protoncogen de la célula hospedera, o la desactivación insercional de un supresor de oncogen lo cual puede ocurrir a través de tres mecanismos: integración al azar, recombinación homóloga o inserción retroviral. En el caso específico de la inducción potencial de tolerancia inmune y autoinmune se ha demostrado, que en organismos sanos el ADN de doble cadena no es capaz de inducir anticuerpos anti-ADN y que estos solos han podido observarse después del inoculo a ratones sanos con ADN desnaturalizado y acomplejado a otra proteína y coadministrado con adyuvante completo(14,15). En trabajos anteriores de nuestro grupo, se puso en evidencia la expresión de antígenos del parásito en el músculo de los ratones BALB/c inmunizados, y se determinó una respuesta humoral y celular específica inducida por la inmunización con la biblioteca genómica de expresión de este parásito. Al mismo tiempo, se comprobó la protección específica conferida en los animales después de ser inmunizados con ADN de T. cruzi(16). En este trabajo examinamos si la inmunización con ADN está involucrada o no en la producción de anticuerpos antinucleares, anticuerpos anti doble cadena (ds ADN), simple cadena (ss ADN), factor reumatoideo IgG, y en la determinación de anticuerpos antimúsculo cardíaco descritos en algunos informes durante el curso de la respuesta inmune(17-19). Materiales y Métodos Construcción de la biblioteca genómica de expresión Cepas parasitarias Se utilizaron epimastigotes de la cepa Y (CT-IOC 106) T. cruzi. (Instituto Oswaldo Cruz, Río de Janeiro, Brasil) en medio liquido(20). Promastigotes de la cepa MHOM/77/LTB0016 de Leishmania amazonensis (Instituto Oswaldo Cruz, Río de Janeiro, Brasil). Cepas bacterianas Escherichia coli (E. coli) XL-1 Blue: F: Tn10 proA+B+ lacl9 (lacZ) M15/ recAl endAl gyrA96 (Nal1) thi hsd r17 (rk-mk-) supE44 relAl lac. (Stratagene). Plásmido Se empleó el vector comercial pcDNA3. Vector de expresión en células superiores suministrado por la firma Invitrogen. Hold Madison, USA. Animales Se emplearon ratones machos, de la línea isogénica BALB/c con un peso entre 16 y 18 gramos y 6 semanas de edad, suministrados por el Centro Nacional de Producción de Animales de Laboratorio (CENPALAB, Bejucal, CUBA) los cuales fueron mantenidos en condiciones controladas de temperatura 200C ± 20 C y humedad 60% con alimentación y agua ad libitum. El cuidado y las manipulaciones experimentales se realizaron por el personal de la Dirección de Modelos de Animales del Instituto “Carlos J. Finlay” y el Instituto “Pedro Kourí” (IPK). Este trabajo se llevó a cabo respetando todos los procederes experimentales con posibilidad de causar dolor o sufrimiento, respetando las normas de la ética de la investigación con animales(21). Medios de cultivo Medio Luria Bertaini (LB)(22). Compuesto por Tryptona al 1%, Cloruro de Sodio al 0.5%, Extracto de Levadura al 0.5%, se ajustó a pH 7.5 y se esterilizó en autoclave a 121°C, 1 atmósfera durante 20 minutos. Para el medio sólido se empleó agar técnico #1 al 1%. (Biomeriux). Medio Infusión de Hígado-Tryptosa (Biomeriux, Francia) suplementado con 10% de suero fetal de ternera (Gibco) y 50 µg/ml de Gentamicina(20). Antibióticos Se usó Tetraciclina a una concentración de 12.5µg/mL, ampicillina a 50 µg/mL y Gentamicina a 50 µg/mL (Boehringer Mannheim Biochemica Alemania). Patrones de peso molecular Se empleó el patrón de peso molecular (PPM) lV (Boehringer Mannheim Biochemica, Alemania) que contiene fragmentos de: 19329/ 7743/ 5526/ 4254/ 3140/ 2690/ 2322/ 1882/ 1489/ 1150/ 925/ 697/ 421/ 74 pb. Para el ensayo de Western Blot se utilizó el patrón de peso molecular (Sigma, USA) cuyo rango de peso molecular es de 14-70 KDa. Obtención de antígenos solubles y citoplasmático de T. cruzi Epimastigotes de la cepa Y (CI-10C 106) de T. cruzi, fueron cultivados en medio líquido(20). El botón celular obtenido fue sonicado (18 Hz, Soniprep 120, England) por tres veces durante 60 segundos. Finalmente el homogenizado fue centrifugado a 1200 g x durante una hora a 4ºC y el sobrenadante fue distribuido en viales de 1 mL y conservado a -70ºC. Posteriormente se determinó la concentración de proteínas por el método de Lowry(23). Construcción de la biblioteca genómica de T. cruzi Se siguió el mismo método de obtención y preparación del ADN genómico de T. cruzi, así como de la construcción de la biblioteca genómica de expresión del mismo descritas anteriormente(16). Brevemente, la mezcla de ligamiento, ADN genómico de T. cruzi con el ADN plasmídico del vector pcDNA3 fue transformada por electroporación en células competentes de la cepa HB101 de E. coli. Los clones recombinantes fueron comprobados por electroforesis en gel de agarosa al 0.8% con Bromuro de Etidio, utilizando como control el plásmido nativo digerido con la misma enzima. Para la amplificación de la biblioteca genómica el resto del precultivo (980 µL), fue sembrado en 500 mL de LB con Ampicillina por 16 horas, a 37ºC con agitación (150 rpm). El material purificado fue diluido en solución salina 0.9% estéril, hasta obtener una concentración final de 250 µg/mL, y fue conservado a -20ºC hasta el momento de su uso. El porciento de recombinantes se calculó de la siguiente forma: Porciento de recombinantes = Número de clones recombinantes x 100 Número de colonias ensayadas Esquema de inmunización Los animales fueron divididos en 5 grupos: L: Grupo inmunizado con la biblioteca genómica de T. cruzi (n = 20). T: Grupo inmunizado con antígenos solubles de T. cruzi. (n = 16) P: Grupo inmunizado con el plásmido pcDNA3(n = 16). G: Grupo inmunizado con ADN genómico de T. cruzi (n = 16). C: Grupo no inmunizado (n = 16). Dosis y vía de administración Se administraron 25 µg de inóculo en 0.1 mL de solución salina al 0.9%, por vía intramuscular, en la región anterior de la pata trasera derecha, con excepción del grupo C que no fue inmunizado. Reinmunizaciones y obtención de las muestras Fueron reinmunizados 10 animales del grupo L, de los cuales 5 recibieron 25 µg (L2) y el resto50 µg (L3) de la biblioteca, por la misma vía y región. El resto de los animales de este grupo no fueron reinmunizados (L1). Se reinmunizaron además, 5 animales del grupo T con una dosis de 25 µg por la misma vía y región (T2), el resto de los animales de este grupo no se reinmunizaron (T1). A cinco animales de cada grupo se les extrajo sangre del seno retrorbital con capilares de vidrio heparinizados, semanalmente durante las cinco primeras semanas post-inmunización, realizándose una extracción adicional en la sexta semana. A los grupos L2 y L3 sólo se les extrajo sangre en la sexta semana, a los 15 días de realizada la reinmunización. Los sueros se obtuvieron por centrifugación a400 g x a 4°C y fueron utilizados para los estudios de autoinmunidad (IFI y ELISA). Determinación de respuestas autoinmunes A los sueros obtenidos de los grupos L,P,G,T y C se les realizó la determinación de anticuerpos anti-ADN de doble y simple cadena, anticuerpos antimúsculo cardíaco y de Factor Reumatoideo de tipo IgG, mediante el método de ELISA, así como se le realizó la determinación de anticuerpos antinucleares por IFI. Determinación de anticuerpos anti-ADN de doble cadena Se utilizó un ELISA cualitativo de tipo indirecto para la detección de anticuerpos(24). Brevemente, las placas fueron recubiertas con poli-L lisina (Sigma) diluida en Solución Salina tamponada con fosfato (SSTF) (NaCl, 54mM; K2HPO4, 1.9mM; Na2HPO4 8.1 mM; KCL, 5.4 mM) pH 7.2 a concentración de 5 µg/mL (100 µL /pocillo) a 37ºC luego se lavaron tres veces con solución de lavado SSTF pH 7.2. Se utilizó ADN para el recubrimiento (timo de ternera, Merck), a una concentración de 5 µg/mL, previamente filtrado a través de una membrana de acetato de celulosa con poro de 0,45 micras (Sartorious). (100 µL/ pocillo) incubado 16 h a 4ºC en atmósfera húmeda. Las muestras se diluyeron 1:100 en el diluente SSTF Tween 20 al 0.05% más suero de caballo al 5% y se depositaron 100 µL/pocillo y por duplicado 1 hora a 37ºC en cámara húmeda. Se utilizó como anticuerpo secundario una anti-inmunoglobulina G (anti IgG) de ratón marcado con fosfatasa alcalina (Sigma), obtenida en conejo a una dilución de 1:8000. El diluente empleado fue el mismo utilizado en las muestras100 µL/ pocillo 1 hora a 37ºC. Se realizaron tres lavados iguales a los descritos anteriormente y se depositó el sustrato paranitrofenilfosfato (PNFP) 10 mg en 10 mL de Buffer de dietanolamina 100 µL/pocillo durante 30 min. a temperatura ambiente. La reacción se detuvo con hidróxido de sodio 3N, 50 µL por pocillo. La lectura de los resultados se efectuó en un Espectrofotómetro modelo Reader MicroELISA System (Organon-Teknika) a una longitud de onda de 405 nm. Se consideró como valor de corte dos veces la media del control negativo, en el suero de los diferentes grupos estudiados. Determinación de anticuerpos anti-ADN de simple cadena Se utilizó la misma metodología para la determinación de anticuerpos anti-ADN de doble cadena, excepto que el ADN fue calentado a 100ºC durante 15 minutos para su desnaturalización y luego enfriado rápidamente en una solución de SSTF pH 7.2 y en lugar del suero de caballo al 5% se utilizó como diluente de las muestras y del conjugado SSTF-albúmina sérica bovina al 2%-Tween 0.05%. Determinación de anticuerpos antinucleares Se realizó mediante IFI, utilizando como sustrato hepatocitos provenientes de una suspensión celular de hígado de rata(25). Brevemente, se extrajo el hígado de una rata Wistar de 250 gramos (CENPALAB) y se realizaron los cortes. Se maceraron los fragmentos añadiendo poco a poco el SSTF pH 7.2, con suero fetal de ternera al 7%. Se aislaron los hepatocitos mediante un gradiente de Ficoll Telebrix d = 1.080 por centrifugación a 400 g x durante 20 minutos. Se realizó conteo en cámara de Neubauer y se ajustaron las células a 5 millones por mL. Se añadieron 10 µL en cada pocillo de la lámina portaobjetos y se dejó secar. Luego se fijaron las láminas con acetona fría y se conservaron a –20ºC hasta el momento de su utilización. Los sueros de los ratones se diluyeron 1:10 en solución salina tamponada con fosfato pH 7.2. Se incubaron con los hepatocitos durante 30 minutos. Como anticuerpo revelador se utilizó una anti-inmunoglobulina G de ratón obtenida en conejo y marcada con isotiocianato de fluoresceína (Centro de Inmunología Molecular, Cuba) diluida 1:50 en SSTF. Las láminas se observaron bajo lente de inmersión en aceite, con un aumento de 1000 en un microscopio equipado para epifluorescencia (Carl Zeiss Jena). Se consideraron positivas las muestras que presentaron fluorescencia nuclear que correspondiera al menos con uno de los patrones descritos (Difuso, Granular, Núcleolar y Homogéneo)(26). Determinación de anticuerpos contra músculo cardíaco Se siguió el mismo método(16) utilizado para el ensayo de IFI, pero los cortes de tejidos fueron realizados a corazones de ratones normales; se realizaron cortes por congelación de aproximadamente 4 µm de espesor, con un criostato (Friostat Lentz). Los cortes de tejido se adhirieron en láminas porta-objetos, se dejaron secar al aire y se fijaron en acetona fría (4°C) durante 10 min.; a continuación, fueron enfrentados con el suero de los ratones de los diferentes grupos a una dilución de diluidos en SSTF e incubados durante 30 minutos a 37°C, luego fueron incubados por el mismo tiempo con el segundo anticuerpo unido a la fluoresceína 1/20 diluido en SSTF y fueron revelados en la misma forma descrita con anterioridad. Determinación del factor reumatoideo Se realizó según el método descrito por Sánchez(27). Se recubrieron las placas con IgG de conejo purificadas por Proteína A (Staphylococcus aureus) a 10 µg/mL, diluida en buffer carbonato (Na2CO3, 0.015M; NaHCO3, 0.035M; NaN3, 0.0031M) a pH 9.6 (100 µL/pocillo) toda la noche a 4ºC en cámara húmeda. Las placas fueron lavadas con solución de lavado SSTF Tween 20 al 0.05 %. Se bloqueó con leche descremada al2 % 100 µL/pozo. Se incubó 1 hora a 37ºC y se rea-lizó lavado igual. Las muestras fueron diluidas 1:100, utilizando como diluente SSTF Tween 20 al 0.05% con albúmina sérica bovina al 2%. Se depositaron 100 µL de las muestras por pocillos. Se utilizó un segundo anticuerpo antiinmunoglobulina G de ratón (Sigma) obtenida en chivo, marcada con peroxidasa, a una dilución de 1/10000 en el mismo diluente de la muestras 100 µL/pocillos 1 hora a 37ºC. Como sustrato se utilizó el peróxido de hidrógeno a 0.024% 10 µL, y como cromógeno la orto fenilendiamina (OPD), en buffer citrato fosfato (ácido cítrico 53 mM, Na2 Hpo4 1M) pH 5, 100 µL por pozos y se incubó a 1 hora a 37ºC. La reacción se detuvo con ácido sulfúrico al 12.5%. En el valor de corte se utilizaron los valores de densidades ópticas del grupo no inmunizado, se determinó la media y desviación estándar de las densidades ópticas. Se consideraron positivos los valores dos veces superiores a la media de los negativos. Los valores de corte para la determinación de ADN de doble y simple cadena, como para la determinación de factor reumatoideo, fueron definidos como la media +2 SD en el grupo de los ratones no inmunizados (grupo C). Cada muestra fue analizada por duplicado y la variación entre ensayos fue menos del 10%. Resultados Determinación de respuestas autoinmunes Detección de anticuerpos anti-ADN de doble y simple cadena El estudio resultó negativo con todos los sueros del grupo inmunizado con la biblioteca genómica de expresión de T. cruzi en todos los tiempos establecidos (Grupo L). También fueron negativos los sueros de todos los animales provenientes de los demás grupos de estudio (T, P, G, y C). Detección de anticuerpos antinucleares La detección de anticuerpos antinucleares resultó negativa en todos los tiempos y grupos estudiados. Determinación de anticuerpos contra músculo cardíaco No se demostró la presencia de anticuerpos contra músculo cardíaco en ninguno de los animales de los grupos estudiados. Detección del factor reumatoideo tipo IgG en ratones inmunizados con la biblioteca genómica de expresión de T. cruzi Como se observa en la figura 1, en el grupo de ratones inmunizados con la biblioteca genómica de expresión de T. cruzi, hay un aumento del factor reumatoideo en las determinaciones de los día 7 y 21, obteniéndose en todos los animales valores por encima del valor de corte. En el grupo inmunizado con ADN genómico del parásito, el factor reumatoideo alcanza un valor máximo en la determinación del día 14, encontrando en algunos de los animales valores por encima del valor de corte.
Discusión Determinación de respuestas autoinmunes Determinación de anticuerpos anti-ADN de doble cadena No se produjo una respuesta frente a determinantes antigénicos conservados, presentes en el ADN de doble cadena, lo que coincide con otros autores quienes después de inmunizar con un gen del factor IX humano y otros genes(28,29) no detectaron anticuerpos contra el ADN de doble cadena post-inmunización. Esta falta de respuesta pudiera explicarse por varios mecanismos entre los cuales se encuentran: la rápida transcripción y traducción de los genes de T. cruzi lo cual polariza la respuesta inmune hacia las proteínas y no hacia el ADN(30), la inducción de la tolerancia a nivel de linfocitos B específicos mediante la eliminación física31 y la edición de receptores(32) o inactivación funcional(33). Otros factores que pudieran estar implicados en la falta de respuesta frente al ADN son los linfocitos T supresores(34) o las interacciones idiotipo-antiidiotipo(35) y aspectos relacionados con la forma de administración del ADN. Sólo se han logrado respuestas de anticuerpos específicos después del acoplamiento del ADN a una proteína transportadora, seguida de su administración con adyuvante completo de Freud(36). Detección de anticuerpos anti-ADN de simple cadena La falta de producción de anticuerpos anti-ADN de simple cadena y de otros anticuerpos antinucleares en los ratones inmunizados con la biblioteca de expresión, podría explicarse por los mismos elementos que planteamos anteriormente, aunque es mucho más frecuente la detección de linfocitos B que reconocen el ADN de simple cadena en sujetos normales(37). Nuestro trabajo brinda resultados divergentes a los obtenidos por Katsumi y colaboradores(28) quienes encontraron altos niveles de anticuerpos dirigidos contra el ADN de simple cadena después de la inmunización con el gen del factor IX humano. La discrepancia con respecto a los resultados obtenidos pudieran explicarse por la diferencia de los esquemas de inmunización empleados, ya que en el trabajo de inmunización con el factor IX se utilizó un mayor número de dosis, con intervalos de tiempo reducidos entre las mismas. La ausencia de respuestas frente al ADN de timo de ternera, utilizado en el ensayo, no excluye la posibilidad de que se produzcan anticuerpos dirigidos contra el ADN de T. cruzi. Determinación de anticuerpos contra músculo cardíaco No se produjo respuesta de anticuerpos contra músculo cardíaco en el grupo inmunizado con la biblioteca de T. cruzi. La realización de este estudio en el presente trabajo estuvo motivado por las características de la Enfermedad de Chagas, en la que con gran frecuencia los individuos crónicamente infectados presentan una pan-miocarditis con infiltrados inflamatorios mononucleares, dependiente probablemente de una reacción de tipo autoinmune(38). También, en el curso de la enfermedad se producen autoanticuerpos de diferente especificidad, entre los que se encuentran los dirigidos contra el endocardio y estructuras vasculares cardíacas(38). La génesis de este tipo de reacción autoinmune se cree que es debido a la reactividad cruzada entre los antígenos del parásito y estructuras del tejido cardíaco(16). A pesar de la demostración por IFI de la expresión de antígenos de T. cruzi en el tejido muscular después de la inmunización con la biblioteca de expresión de este parásito, no se detectaron respuestas autorreactivas, lo que puede explicarse por diferencias en la expresión y localización de los antígenos parasitarios después de la inmunización con ADN(16). Este elemento apunta hacia la posible utilización de la inmunización con genes del parásito para la prevención de la enfermedad, sin el riesgo de inducir manifestaciones autoinmunes similares a las producidas en la infección natural. Detección de factor reumatoideo El patrón de respuestas del factor reumatoideo después de la inmunización de los animales con la biblioteca de expresión, se asemeja a la producción de anticuerpos específicos en el marco de una primo infección o una primo vacunación. La producción de factores reumatoideos IgG en los ratones inmunizados con la biblioteca genómica del parásito, puede deberse a la producción de inmunocomplejos o a la estimulación inespecífica del sistema inmune por el ADN que se administró. Los linfocitos B, con actividad del factor reumatoideo, son abundantes en la zona del manto de los ganglios linfáticos y las amígdalas en sujetos en los que no se detectan factores reumatoideos en el suero. Estos linfocitos autorreactivos podrían haber escapado del proceso de deleción clonal sin tener ninguna función en particular. Sin embargo, algunos autores sugieren la posibilidad de que la función principal de estos linfocitos B sea independiente de la secreción de anticuerpos y que esté relacionada con el procesamiento de los antígenos atrapados en los inmunocomplejos(39). En el marco de respuestas inmunes de tipo secundario, pueden encontrarse frecuencias de linfocitos B con actividad de factor reumatoideo tan altas como la de linfocitos específicos de antígenos(40). Se piensa que la expresión de linfocitos B específicos con actividad de factor reumatoideo es dependiente de linfocitos T y hasta el momento no se ha demostrado la existencia de linfocitos T que reconozcan IgG autóloga(39). Se ha demostrado que para la producción de respuestas contra factor reumatoideo en el marco de una respuesta inmune secundaria se necesita la presencia de linfocitos específicos de antígenos(41). La infección experimental de ratones con protozoos, incluyendo T. cruzi induce la producción de autoanticuerpos(42,43). En nuestro experimento, demostramos la expresión de antígenos del parásito y la producción de anticuerpos específicos, lo cual pudiera inducir la formación de inmunocomplejos y la producción subsiguiente de factor reumatoideo. La estimulación inespecífica por el ADN administrado pudiera explicar también la presencia de factor reumatoideo, ya que se ha demostrado una estimulación inespecífica del sistema inmune después de la administración de ADN bacteriano de alto peso molecular y oligodeoxinucleotido (motivos CpG)(44). Se ha reportado que en ratones inyectados con ADN bacteriano o con oligodeoxinucleótidos que contenían la secuencia CpG se produce una estimulación de los linfocitos B, T y células AN, con la producción de la interleucinas 6 y 12, así como la producción de Interferón Gamma, lo que lleva a más del 95% de las células B a entrar en el ciclo mitótico y producir inmunoglobulinas(45). Los macrófagos también responden a la presencia de ADN exógeno produciendo Factor de Necrosis Tumoral alfa(46). De esta forma, el reconocimiento del ADN extraño contribuye a la producción de citocinas y a la activación policlonal vista en muchas infecciones(47). Estos efectos del ADN sobre la respuesta inmune pudieran estar implicados en la producción de factor reumatoideo detectada en nuestros experimentos, después de la inmunización con la biblioteca de expresión. Hasta el momento, no existen reportes que hayan estudiado el comportamiento del factor reumatoideo después de la inmunización con ácidos nucleicos. Determinación de anticuerpos antinucleares No hubo presencia de anticuerpos antinucleares en ninguno de los animales de los grupos estudiados, hecho que podría explicarse por lo anteriormente discutido al analizar la respuesta de anticuerpos contra el ADN de simple y doble cadena. Teniendo en cuenta los estudios realizados no se puede afirmar de forma categórica que la inmunización con ácidos nucleicos no es un factor desencadenante de autoinmunidad, ya que el fenómeno autoinmune en general y el asociado a la Enfermedad de Chagas en particular es altamente complejo con múltiples manifestaciones, con gran cantidad de mecanismos potenciales de producción y que se presenta en forma dinámica con el paso del tiempo. Los estudios realizados en relación con la autoinmunidad cubren un espectro limitado de posibilidades, fundamentalmente asociados con las manifestaciones autoinmunes potencialmente derivadas de la inmunización con ADN. Finalmente, con este trabajo pretendemos estimular la búsqueda de nuevas variantes en la inmunización con ácidos nucleicos de organismos eucariota, como el parásito que nos ocupa, considerando esta tecnología como una herramienta útil para la identificación de antígenos o la preparación de vacunas de última generación. Referencias 1. 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Correspondencia: Dr. Esteban Alberti Amador Centro Internacional de Restauración Neurológica Departamento de Neurobiología Laboratorio de Biología Molecular Ave. 25 # 15 805 e/ 158 y 160, Cubanacan, Playa CP 11 300, Ciudad de La Habana, Cuba. e-mail: alberti@neuro.ciren.cu |
